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可示踪的防龋基因疫苗构建、表达及其基因疫苗PELA微球的研究

刘莉

  本研究将微生物学、免疫学、分子生物学和生物材料学等多学科有机结合起来,运用基因重组技术构建了可示踪的防龋基因疫苗;对可生物降解材料作为防龋基因疫苗释放系统进行了研究;并对防龋基因疫苗在体内外的表达以及不同方式免疫的BALB/C小鼠的特异性抗体进行了检测。通过GFP的指示作用及免疫组化方法,对防龋基因疫苗在体内外的表达进行初步的示踪研究,为防龋基因疫苗的临床应用奠定基础。本研究共包括四个部分。第一,本研究构建了以绿荧光蛋白基因作为报告基因的可示踪的防龋基因疫苗。利用PCR方法,扩增变异链球菌(Streptococci mutans,S.mutans)MT8148菌株表面蛋白抗原PAC氨基端的基因片段pac-A(1.3Kb)。PCR产物与真核表达质粒pEGFP-C1双酶切,并回收相应DNA片段后,采用DNA连接试剂盒进行连接重组,转化。转化子中的重组质粒经双酶切鉴定,获得了4.7Kb与1.3Kb两个片段;重组质粒中插入基因的序列测定表明,该插入序列与pac全基因的314-1630bp的核酸序列完全相同,插入基因的两侧分别与Kpn Ⅰ和Apa Ⅰ酶切位点的序列一致,插入基因的上游有起始密码子,下游有终止密码子。以上结果均证实该重组质粒构建正确,目的基因pac-A定向插入至真核表达载体中,未改变目的基因的阅读框架。我们将此重组质粒命名为pEGFPC1-pacA。该重组质粒的成功构建为下一步实验的顺利进行提供了可靠的保障。第二,为了检测构建的可示踪的防龋基因疫苗能否在哺乳动物细胞中正博士学位论文一摘要确表达出来,将构建正确的重组质粒pEGFPCI一pacA采用脂质体Lipofectin试剂介导转染COSI细胞。通过荧光倒置显微镜直接观察和流式细胞仪测定荧光强度指示GFP的表达;采用RT一PCR法检测重组质粒中那c叨基因在COSI细胞中的转录;并用蛋白质免疫印迹杂交(Western blot)检测转染细胞上清液pac一基因的表达。结果在荧光显微镜下观察到了发绿色荧光的Cosl细胞,重组质粒组细胞的平均荧光强度高于阴性对照细胞组,表明重组质粒能正确表达出绿荧光蛋白;RT一PCR扩增获得了1,3Kb的片段;表达产物的Western blot结果显示,在分子量为56 KD与89 KD处有两条杂交阳性带,其分子量分别与pa酬基因表达产物与Pac胡下了力融合基因表达产物的推算值相符,表明重组质粒中pac一与g巾基因能正确表达并可分泌至胞外,而且能与特异性抗体结合,具有免疫学生物活性。上述结果表明,构建的可示踪的防龋基因疫苗能在哺乳动物细胞中正确表达出来,报告基因g动与目的基因pa酬在哺乳动物细胞中具有转录和翻译活性及其相应的生物学活性,这为可示踪的防龋基因疫苗的动物体内实验提供了良好的材料。第三,本实验旨在为防龋基因疫苗寻找一种有效的释放系统。以聚乳酸一聚乙二醇共聚物(PELA)为材料,采用改进的溶剂挥发法双乳液(Wl/o/W2)体系制备DN刀PELA复合物,在扫描电镜下观察其形态、粒度分布仪测定平均粒径;测定了复合物中DNA的包封率、细胞外释放特征,及其包被对DNA结构的影响;采用MTT法测定了PELA包被材料本身的细胞毒性;并对其介导的DNA体外转染真核细胞的效果进行了检测。结果显示所制备的复合物多为球形,平均粒径1.806腼;微球中DNA的包封率达78.9%,在细胞外具有缓释的特征,DNA结构没有被破坏;PELA材料本身对细胞基本无毒性;DN户JPELA微球能在体外直接转染COsl细胞,在荧光倒置显微镜下观察到了发绿色荧光的被转染细胞:流式细胞仪测定重组质粒DN刀PELA微球细胞组的平均荧光强度比阴性对照细胞组的高,但比阳性对照细胞组低;用RT一PcR检测重组质粒阳性对照组及DN刀PELA转染组的pac一基因的转录,结果显示,重组质粒阳性对照组细胞和DNA/PELA组细胞组均能检测出pac一基因的转录,但初步判断后者的转录水平较前者低。上述结果表明被微球包裹的DNA能在体外转染哺乳动物细胞,并在细胞内正确地转录、翻译出相应的产物,其生物学功能没有被破坏。但在体外转染效率较低,其原因可能与微球缓慢释放被包裹的DNA有关。博_卜学位论文一摘要第四,为了进一步证实构建的可示踪防龋基因疫苗的免疫学活性,以及PELA基因疫苗释放系统对免疫效果的影响,我们进行了小鼠体内实验。将基因疫苗裸DNA和DN刀PELA微球分别以单剂肌注,多次肌注,口服接种等方式对BALB/C小鼠进行免疫,通过ELISA法检测血清特异性抗体。结果显示基因疫苗DN刀PELA微球免疫组的免疫效果比裸DNA免疫组好;在减少免疫次数,甚至单剂免疫,也能取得较好的免疫效果;而且DN户JPELA微球经口服免疫后,尽管免疫效果较肌注免疫差,但仍比裸DNA免疫组的免疫效果好。上述结果表明PELA包被基因疫苗后,可增强免疫效果,减少接种次数,并可通过口服方式进行免疫。本实验还通过GFP的指示作用及免疫组化法对基因疫苗在实验小鼠体内各组织的分布进行了示踪研究。在荧光显微镜下观察组织中绿色荧光的表达,并用免疫组化法检测组织中娜c一基因片段的表达。结果发……   
[关键词]:防龋基因疫苗;绿荧光蛋白;转染;基因疫苗微球;PELA
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:四川大学2003年