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可得兰多糖(Curdlan)发酵工艺及分子结构的研究

李志昂

  可得兰多糖(Curdlan)是微生物发酵生产的直链无分枝的β—(1-3)—葡聚糖,具有加热形成凝胶的特殊性质,在食品、轻工、医药、保健等领域有广泛的应用开发前景。本论文以诱变、筛选得到的Alcaligenes faedelis Var. C125菌株为生产菌株,研究C125菌株产Curdlan的发酵特性,应用响应面法优化了发酵培养基的组成和发酵培养条件;研究发酵后Curdlan的提取、纯化和分离工艺;分析分离纯化得到的Curdlan CD-3样品的分子结构并对其进行初步的分子结构改造研究。主要的研究内容如下:1)对菌株C125培养的单因素实验研究表明葡萄糖、蔗糖、糖蜜和可溶性淀粉作为发酵的碳源都可以生产Curdlan,但以葡萄糖为最佳碳源,适宜的加入量为45g.L(~-1);酵母粉为菌株C125的最佳氮源,适宜的添加量为8.5g.L~(-1);加入适量的碳酸钙(2.5g.L~(-1))不仅可以促进Curdlan的发酵生产,而且能够维持发酵液的pH的稳定。正交实验表明碳源和氮源对Curdlan发酵生产的影响显著,混合无机盐(K_2HPO_4+MgSO_4)有较显著影响,柠檬酸钾无显著影响;正交实验优化的发酵培养基组合为(g.L~(-1)):葡萄糖40,酵母粉8.5,混合无机盐2.0+0.2,柠檬酸钾0.2,其Curdlan产量为28.22g.L~(-1)。尿嘧啶和KH_2PO_4对菌株C125发酵生产Curdlan有较大的影响,KH_2PO_4添加浓度为2g.L~(-1),尿嘧啶的添加量不能低于0.3g.L~(-1)。利用响应面法获得的最优培养基组合为(g.L~(-1)):葡萄糖,49.5、酵母粉,7.64、尿嘧啶,0.32、KH_2PO_4,2.72和(NH_4)_2HPO_4,1.16。以优化的培养基组合发酵95小时,所得的Curdlan产量为25.03g.L~(-1)。菌株C125菌体生长与产Curdlan为部分偶联,发酵前期是菌体对数生长阶段,没有Curdlan产出,在氮源基本消耗完后菌体才开始产Curdlan。2)单因素实验表明Curdlan发酵种子液适宜的种龄和接种量分别为10h和10%;摇瓶装液量和摇床转速分别为500ml摇瓶装100~125ml培养基和200rpm;助溶氧剂PPE和菜油可以改善发酵液的溶氧水平,有助于提高Curdlan的发酵产量,而用H_2O_2作助溶氧剂则不可取;合适的发酵温度在30~32℃;发酵培养基合适的初始pH为6.5,发酵周期为95h。应用响应面设计优化的Curdlan发酵的培养操作条件为:种龄9.9h,接种量9.8%,摇床转速208rpm,发酵培养基初始pU 6.1,发酵时间93.9h,在优化的培养条件下,发酵生产Curdlan,得到的发酵多糖产量为24.69g.L~(-1)。3.7L自动发酵罐实验表明优化的培养基组成和培养条件适宜进行罐发酵,可以此为基点继续优化;考察罐发酵过程中Curdlan浓度与发酵液粘度的变化趋势和两者的关系,得到用发酵液粘度预测Curdlan产量浓度的模型方程,简化了发酵过程Curdlan浓度的检测手段及对发酵条件的控制。3)用不同方法研究C盯dlan的提取工艺,结果表明醇析法和酸碱法是CUr以an粗多糖较合适的提取工艺。经优化的提取工艺为:醇析法添加乙醇3一5倍(v/v)、醇析次数3次;酸碱法加等体积IM的氢氧化钠溶液,使碱的终浓度在0.5M以下,ZMHCI调节PH至中性使C班dian沉淀,然后离心和醇洗。C切dlan粗多糖用女v越笋法脱蛋白5一7次,流水逆向透析得Cur山阻半纯品CL卜2样品,cD一样品用s喇血睐G-100,S喇血 lex G.200分离和纯化得到cur山劝CD一3样品;Sepha印sex一oo和紫外光谱检测表明CD一3样品为高纯度的CUr山an;CD.3样品为白色粉末,理化实验表明具备Ourdian的特性。4)纸层析和高碘酸钠氧化实验确定CD.3是一种以1一3葡萄糖昔键连结的单糖组份单一的多聚葡萄糖;S叩枷叨义x,200柱层析求得CD~3的分子量为457以犯al;刚果红实验表明CD一3在稀碱溶液中(浓度<0 .4mo切卜1)存在三股螺旋构象。红外光谱和核磁共振图谱分析证明,CD.3具备标准Curdlan的分子结构。采用低取代度法和SPC法制备得到C班dian硫酸化衍生物(CDRS),有效改善了C班.dian的水溶性,红外光谱显示cDRs有硫基(一0503)的吸收峰和p一D一(l一3升葡聚糖的特征吸收峰。制备得到Ourdian梭甲基化衍生物(CM.CD)样品,能够溶解于水且保持热凝胶性能,取代度为0.5。红外图谱显示梭甲基的吸收峰和p一D一(l一3)葡聚糖的特征吸收峰;核磁共振图谱显示在c班山an的q和q位置的轻基(.OH)被梭甲基取代(一oc玩cooH)。……   
[关键词]:产碱杆菌C125突变株;可得兰多糖;响应面;发酵;提取;纯化;分子结构
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:浙江大学2003年