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苦皮藤素Ⅴ免疫分析技术的研究

杨润亚

  新农药的创制是农药研究开发的一个主要目的。对天然产物进行研究,从中寻找先导化合物或新的作用靶标是创制新农药的重要途径。苦皮藤素Ⅴ是从卫矛科植物苦皮藤中分离出的一种具有杀虫活性的天然产物,可能作用于一类新的作用靶标。20多年对苦皮藤及苦皮藤素Ⅴ的研究已取得了重要进展,但迄今还没有证实苦皮藤素Ⅴ的作用靶标,对苦皮藤素Ⅴ在生物体内的药代动力学研究也尚未涉及,这些方面的研究因为对痕量苦皮藤素Ⅴ在生物体内分析、检测存在技术方法上的困难而受到限制,建立苦皮藤素Ⅴ的免疫分析技术则可解决这些问题。国内外迄今还没有这方面的研究报道。进行苦皮藤素Ⅴ免疫分析技术的研究,可为深入研究苦皮藤素Ⅴ作用机理提供技术手段,促进农药毒理学和开发新农药的研究。为此,本研究系统地研究了苦皮藤素Ⅴ的免疫分析技术,包括苦皮藤素Ⅴ人工抗原的合成、苦皮藤素Ⅴ抗血清的制备、苦皮藤素Ⅴ的免疫分析定位以及苦皮藤素Ⅴ的定量测定。研究取得如下结果:1.苦皮藤素Ⅴ与琥珀酸酐在无水吡啶条件下加热回流,反应完成后得到白色粉末状固体物103mg,产率为89.57%,HPLC-MS和NMR分析鉴定结果表明,该白色粉末状固体物即为所要制备的苦皮藤素Ⅴ衍生物苦皮藤素Ⅴ-半琥珀酸酯(CA-SG)。2.将CA-SG分别与牛血清蛋白(BSA)及鸡卵清蛋白(OVA)以混合酸酐法合成了苦皮藤素Ⅴ人工抗原CA-BSA(145mg)、CA-OVA(203mg);以碳化二亚胺法合成了人工抗原CA-BSA2(160mg)。分别采用紫外分光光度计法、SDS-PAGE及PAGE对3种人工抗原进行了定性表证。根据人工抗原、载体及半抗原在240nm处的紫外吸光值,计算出3种人工抗原中半抗原与载体的分子结合比率分别为11.6:1、10.3:1及10.7:1;推算出3种人工抗原的分子量约分别为74851D、51859D和74164D。3.用两种方法合成的苦皮藤素Ⅴ-BSA结合物分别免疫家兔,均获得苦皮藤素Ⅴ的特异性抗体。采用琼脂双向扩散法检测不到抗体的产生,而间接ELISA试验结果表明从第四次加强免疫开始可以检测到半抗原苦皮藤素Ⅴ的特异性抗体,而且随着免疫次数的增加,兔子体内苦皮藤素Ⅴ的抗体浓度不断增加,抗体效价最高可达320倍稀释液。4.用制备的抗体进行苦皮藤素Ⅴ的定性检测和在昆虫组织中的定位研究。结果表明,用制备的抗体采用PAGE-Western杂交法不能进行苦皮藤素Ⅴ的定性检测,也不能进行苦皮藤素Ⅴ在昆虫中肠BBMV上的定位研究;而采用点杂交法可以进行苦皮藤素Ⅴ的定性分析,但仍不能进行苦皮藤素Ⅴ在昆虫中肠BBMV上的定位研究。5.用制备的苦皮藤素Ⅴ抗血清进行苦皮藤素Ⅴ的竞争性酶联免疫分析,结果表明,在一定浓度范围内(0 .1563一2.5陀/ml),苦皮藤素V浓度的对数值与其对ELISA试验的抑制率几率值呈良好的线性相关(产一0.8169),建立了一个直线回归方程y一4.2713+l .3908x。通过对两个己知浓度样品中苦皮藤素V含量的测定结果说明利用该方程可以进行苦皮藤素V的酶联免疫测定。通过上述研究和分析,可得出如下结论:1.利用唬拍酸醉法结合混合酸配法或碳化二亚胺法可成功制备出苦皮藤素V的人工抗原;利用苦皮藤素V和牛血清白蛋白合成的人工抗原可制备出苦皮藤素V的特异性多克隆抗体;利用制备出的苦皮藤素V的多克隆抗体可以进行苦皮藤素V的定性检测和定量分析。2.本研究在国内首次研究了植物性杀虫活性物质苦皮藤素V的免疫学技术,在理论上证实了建立苦皮藤素V免疫分析技术的可行性。……   
[关键词]:苦皮藤素Ⅴ;免疫分析技术;人工抗原
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:西北农林科技大学2002年