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牙鲆鲆淋巴细胞的免疫反应动力学研究

乌日琴

  本文主要以牙鲆淋巴细胞为研究对象,通过细胞生物学和分子生物学实验手段对牙鲆的淋巴细胞体内和体外活性作了初步调查。探讨了牙鲆淋巴细胞的异质性问题,并建立了组织化学和细胞培养方法进行了牙鲆T淋巴细胞的动力学研究;初步分析了牙鲆淋巴细胞的表面分子,体外克隆牙鲆TCRβ链受体cDNA ,并对其基因结构进行了生物信息学分析;研究了TCR基因在牙鲆淋巴囊肿病毒感染的鱼体内的表达,以及淋巴细胞在病毒感染过程中的变化。本文共有四个部分组成:第一部分主要是牙鲆淋巴细胞的异质性研究,通过实验解剖学、组织学和电子显微镜观察了解淋巴细胞在牙鲆体内的分布,利用密度梯度离心法分离淋巴细胞,并利用AENE染色检测牙鲆T淋巴细胞,利用有丝分裂原刺激牙鲆淋巴细胞发生转化进一步验证牙鲆淋巴细胞的异质性,并对牙鲆的淋巴细胞培养和体外转化条件进行了探讨。结果表明,牙鲆淋巴细胞主要分布在胸腺、头肾、脾脏和黏膜淋巴组织(MALT)、血液淋巴是鱼类的免疫器官和组织,牙鲆没有骨髓和淋巴结;利用Ficoll-Urographin系统分离牙鲆外周血的淋巴细胞,认为1.083的Ficoll-Urographin系统分离效果较好。牙鲆淋巴细胞扫描电镜下呈现2种不同的表面结构,在扫描电镜下记数,表面粗糙细胞占淋巴细胞总数的56.34%,而表面绒毛均匀的占43.66%;黏附性细胞中75%左右为绒毛均匀细胞,而非黏附细胞中85%是表面粗糙细胞。利用α-醋酸萘酯酶检测牙鲆外周血淋巴细胞,结果显示α-醋酸萘酯酶阳性的淋巴细胞占30.137±5.577%,黏附细胞的AENE阳性率小于2%,非黏附细胞的AENE阳性率大于80%。因此可以认为用α-醋酸萘酯酶染色方法检测牙鲆T 淋巴细胞有效。牙鲆淋巴细胞表面存在PHA和ConA等T细胞增殖因子受体,PHA和ConA均可以刺激淋巴细胞发生增殖。牙鲆淋巴细胞转化实验的最佳条件是:PHA的质量浓度为10 μg/mL,小牛血清是体积分数为15%,牙鲆淋巴细胞转化的最佳温度为20℃。第二部分进行了牙鲆T淋巴细胞动力学研究,通过组织化学、细胞培养和酶连免疫吸附方法检测了T细胞在牙鲆体内的动力学分布,研究牙鲆淋巴细胞转化和细胞免疫关系以及在牙鲆淋巴细胞培养上清液中IL-2样因子的分布。结果表明,外周血淋巴细胞中T细胞的比例随着体重的增加而增加,而胸腺中淋巴细胞的数量则减少,这个可能是由胸腺本身的退化和T淋巴细胞的转移造成的。脾和前肾中T淋巴细胞的数量变化不大,和体重也不呈明显的相关性,因为T淋巴细胞主要在胸腺中发育成熟,然后再迁移到相关的器官组织中。我们在500g体重的牙鲆中没有分离到胸腺,表明胸腺在这个时期已经退化。对T细胞是AENE计数和进行淋巴细胞转化实验的转化率分析表明,两者呈现一定的相似性,这个表明在牙鲆淋巴细胞中发生淋巴细胞转化的细胞主要是T淋巴细胞。在适宜的生长温度范围内,低温延缓或阻止牙鲆细胞免疫应答的发生,导致淋转水平下降。外周血和脾淋巴细胞非特异性淋转水平较前肾高,外周血和脾淋巴细胞的淋转水平没有显著差异。外周血较脾和前肾特异性淋转水平高,而前肾的淋巴细胞转化水平较脾高。注射引起牙鲆应激反应导致淋转水平升高。用植物血凝集素(PHA)刺激诱导牙鲆淋巴细胞,收集细胞上清液,用小鼠胸腺增殖实验、牙鲆前肾淋巴细胞增殖实验,检测上清液中IL-2活性。利用抗人IL-2单克隆抗体检测上清液中IL-2样物质的含量。利用流式细胞仪检测牙鲆外周血淋巴细胞与抗人白细胞表面分化抗原CD25单克隆抗体交叉反应。经过检测,牙鲆淋巴细胞培养上清液中含有IL-2样物质,这种物质可以使小鼠胸腺细胞、牙鲆前肾淋巴细胞有较明显的促增殖作用。不同组织来源淋巴细胞培养上清液中的IL-2含量差异较大,其中以前肾淋巴细胞培养上清液中IL-2含量最高,在PHA刺激的外周血、脾和前肾淋巴细胞培养上清液中IL-2分子的量分别是26.1 pg/mL,34.3 pg/mL和89.8 pg/mL。牙鲆外周血淋巴细胞与抗人白细胞表面分化抗原CD25单克隆抗体交叉反应,阳性率7.74±0.67%。结果提示,牙鲆淋巴细胞培养上清液中含有人类IL-2样物质,并且牙鲆淋巴细胞膜上含有与人类IL-2R类似功能和结构的物质。第三部分进行了牙鲆淋巴细胞表面分子的检测和TCRβ链受体cDNA的克隆。结果表明,牙鲆淋巴细胞可形成典型的E花环,成环率低于2%。牙鲆外周血细胞中含有NK细胞和CD25单克隆抗体交叉反应为阳性。与T细胞抗原、B细胞抗原和其他活化淋巴细胞抗原的交叉反应阳性不明显。从牙鲆外周血淋巴细胞cDNA文库中克隆TCRβ1319bp同源cDNA序列并对其基因结构进行生物信息学分析。其编码区为942bp,编码314个氨基酸,编码区包括V、D、J和C区4个基因片段, TCRVβ片段主要包括从21-115位氨基酸残基的95个氨基酸序列,Jβ区与哺乳动物的Jβ区高度保守,在位于Vβ和Jβ之间的Dβ区中没有发现8碱基保守序列(GGACAGGG),CDR3β氨基酸序列为GTRILYE,牙鲆TCRCβ片段共有179个氨基酸残基,缺失位于Cβ细胞外区和临近区域的2个5-9氨基酸弹性区域。牙鲆TCRCβ片段的铰链区有6个氨基酸残基,缺少半胱氨酸位点,含Lys271 保守位点。经RT-PCR检测,在脾、外周血和前肾中都发现TCRβ的表达,肌……   
[关键词]:牙鲆;淋巴细胞;白细胞;组织化学;表面分子;T细胞表面抗原受体;白细胞介素-2;原位杂交;淋巴囊肿;细胞凋亡
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:中国科学院研究生院(海洋研究所)2003年