手机知网 App
24小时专家级知识服务
打 开
手机知网|搜索

角膜缘移植联合丝裂霉素和血管抑素治疗严重眼表碱烧伤的作用机制研究

刘海俊

  研究目的眼表碱烧伤是一种临床常见而难治的眼病,角膜移植后存在因免疫排斥反应而致手术失败的危险。本研究的目的是:(1)探讨不同浓度的丝裂霉素、血管抑素对体外培养的角膜上皮细胞、基质成纤维细胞和血管内皮细胞的药理和毒理作用,以此来确定丝裂霉素和血管抑素用于动物实验和临床研究的最佳用药浓度。(2)在动物模型上,进行角膜移植术、角膜缘移植术、角膜缘移植术+术中应用丝裂霉素、角膜缘移植+术后应用血管抑素和角膜缘移植术+术中应用丝裂霉素+术后应用血管抑素等方法治疗,从而评估角膜干细胞、丝裂霉素、血管抑素对眼表碱烧伤术后免疫排斥反应的抑制作用。(3)探讨角膜缘干细胞移植联合丝裂霉素和血管抑素治疗严重眼表碱烧伤的临床疗效,比较术前与术后180d时,各指标的变化。材料和方法(1)细胞体外培养的实验研究:兔角膜上皮细胞、基质成纤维细胞和人血管内皮细胞经分离后进行体外培养、传代,传至第2代,分组分孔接种(96孔板),其中1孔为作空白用于调零,其余分为7组,培养至细胞贴壁后,进行如下处理。A组为对照组(12孔),加DMEM培养液;B、C、D组各12孔,分别加入0.1、0.3、0.5mg/ml MMC-DMEM培养液,作用5min后,吸出此液,加入DMEM液,E、F、G组各12孔,分别加入0.1、0.3、0.5μg/ml AS-DMEM液,继续培养观察用药后24h、48h的细胞生长情况,采用MTT法,检测各孔的OD值。计算细胞增殖抑制率,抑制率=[(对照组OD值—实验组OD值)÷对照组OD值]×100%。实验重复3次。(2)严重眼表碱烧伤的实验研究:在25只兔双眼上(用1.0mol/L NaOH溶液)建立眼表碱烧伤模型后编号(1一25号),碱烧伤后ld,1一10号兔的左眼行角膜移植术(l组,角膜移植组)、右眼行角膜缘干细胞移植术(2组,角膜缘移植组),n一巧号兔的双眼行角膜缘移植+术中应用丝裂霉素(0 .25mg/而)治疗(3组,丝裂霉素组),16一20号兔双眼行角膜缘移植+术后应用血管抑素(0 .3林g/ml)治疗(4组,血管抑素组),20一25号兔双眼行角膜缘移植+术中应用丝裂霉素+术后应用血管抑素滴眼液(5组,联合治疗组);25只兔的50眼术后局部均滴FK506滴眼液和复方妥布霉素滴眼液,3/d,维持3mon。术后观察半年。观察指标包括:角膜新生血管、角膜混浊度、角膜水肿度、免疫排斥反应指数、免疫排斥出现的时间及免疫组织化学检测。(3)严重眼表碱烧伤的临床应用研究:8例(8眼)严重眼表碱烧伤患者,行角膜缘干细胞移植术,术中应用丝裂霉素、术后应用血管抑素和FK一506、复方妥布霉素眼液(联合治疗组)。门诊随访,追踪观察不少于180d。根据术后术眼的角膜新生血管分级、植片的混浊度、水肿度来计算移植排斥反应指数(RI),同时,观察了角膜的假性簧肉和患者的自觉症状及检查了患者的视力,并与术前的作了比较。结果(l)细胞体外培养的实验研究:丝裂霉素、血管抑素对角膜上皮细胞增殖的抑制(OD值X士SD)加药后24h,A、B、C、D、E、F、G组的OD值分别是0.241士0.002、0 .217士0.006、0.178士0.001、0.162士0.007和0.251士0.001、0.247士0.085、0.249士0.012;其中c、D组的与对照组的比较具有显著性差异(P=0.00),B组的与对照组的L匕较,无显著差异伊<0.05)。B、e、n细胞抑制率分别为9.9%、26.1%、32.9%,E、F、G无抑制作用。加药后48h,A、B、C、D、E、F、G组的OD值分别是0.862士0.307、0 .1 86士0.006、0.148士0.023、0.105士0.022和0.703士0.102、0.697士0.126、0.705士0.202;B、C、D和E、F、G细胞抑制率分别为78.4%、82·8%、87·8%、18.4%、19.1%、18.4%。MMC各组(B、C、D)与对照组的比较均具有显著性差异(P=0.00),细胞的增殖显著下降;AS各组(E、F、G)之间及与对照组之间,均无显著性差异(P>0.05)。丝裂霉素、血管抑素对角膜成纤维细胞增殖的抑制(OD值X土SD)一2-加药后24h,A、B、C、D、E、F、G组,用MTT法测的OD值分别为0.315士0.038、0.160士0.026、0.179士0.037、0.165士0.023和0.284士o一0.281士0.041、0.281士0.022,用实验组与对照组的比较,均有显著性差异(MMc组P<0.00,AS组P<0.05)。B、C、D细胞抑制率分别为49.3%、43.40,0、47.60,0,E、F、o无抑制作用。加药后48h,各组OD值的分别为0.557士0.123、0.215士0.028、0.208士0 .024、0.205士0.202和0.624士0.077、0.632士0.096、0.593士0.1256,MMC的各组均较对照组的明显下降,组间无显著差异,而AS的各组与对照组比较,虽有下降的趋势,但均无显著差别。B、C、D、E、F、G细胞抑制率分别为61.3%、62.6%、63.2%和10.0%、10.9%、10.9%。丝裂霉素、血管抑素对血管内皮细胞增殖的抑制(OD值又士SD)加药后24h,A、B、C、D、E、F、G组的OD值分别为:0.278士0 .029、0.182士0.018、0.179士0.018、0.169士0.022和0.271士0.033、0.267士0.038、0.260士0.027;B、C、D和E、F、G组细胞抑制率分别为34.2%、35.6%、39.1%和2.3%、3.9%、6.5%。4……   
[关键词]:眼表碱烧伤;角膜干细胞;新生血管;丝裂霉素;血管抑素
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:中国人民解放军第一军医大学2003年