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海藻糖分析方法及高产海藻糖酵母菌的筛选研究

朴春红

  海藻糖,又名覃糖,是由两个葡萄糖残基以α,α-1,1键联结而成的一种非还原性的双糖。其分子式为C_(12)H_(22)O_(11),分子量(含两分子结晶水)为378.23。海藻糖在生物体内除作为结构成分、提供能量以外,最重要的作用是作为一种典型的应激代谢物,在干燥、低温、高渗等许多环境条件下保护生物体细胞内的蛋白质、脂类、糖类、核酸等组分不受破坏,保护细胞免受伤害。海藻糖应用非常广泛,在食品、医疗、分子生物学和农业方面都有重要意义。本研究旨在对海藻糖进行定性定量分析基础上,从16种酵母菌中筛选出海藻糖产量较高的菌株,并通过诱变的方法优选出优良生产菌株,以提高海藻糖产量,且对此菌株的生长条件进行深入研究。首先采用德国制GF254薄层层析板,展开剂为正丁醇:吡啶:水=15:3:3,点样量0.4μg,二次展开后用硫酸:甲醇=1:4溶液在105℃显色,在此条件下海藻糖灵敏度为0.04μg,较已报道的薄层层析法提高了近50倍。试验通过采用二次展开的方法,降低了试验的成本,为预制板的普及应用打下了基础。为便于一般实验室对海藻糖进行定量检测,本研究采用硫酸蒽酮法、旋光法和薄层扫描法等传统方法对海藻糖进行了定量检测研究。结果表明,硫酸蒽酮法相关系数为0.9821,可以应用于海藻糖的定量检测,但因其受样品中其他糖类成分的影响,必须用校正系数加以校正。为了能够准确定量从酵母中提取的海藻糖含量,针对酵母的提取液,分别采用旋光法和用质谱法进行了海藻糖的定量分析。结果表明,两者之间存在高度正相关,对应的回归方程为^Y=0.697X+0.2534(旋光度为因变量,液质联用仪测定的海藻糖含量为自变量)。薄层扫描法定量分析海藻糖的变异系数为10%左右,因此也可以作为样品中海藻糖定量检测方法。分析方法确定之后,本研究即从实验室保存的12种酵母菌和从采自长白山温泉的土样、发酵蜂蜜中分离出的酵母菌中进行了高产海藻糖菌株的筛选。以酵母抽提液海藻糖含量为指标,筛选出海藻糖高产酵母B-15,经物理和化学相结合的诱变结果,最终筛选出高产酵母ZY-D-10,其菌体内海藻糖含量为155.23mg/g,比出发菌株提高0.8倍。继而对这一高产菌株从温度、培养时间和pH值等生长条件进行了研究,最后确立酵母菌ZY-D-10培养条件为培养温度32℃,培养时间27小时,初始培养吉林农业大学硕士学位论文.海藻枪分析方法以及高产海旅搪酵母菌株的筛选研究基PH值为6 .5。经上述条件培养后菌体海藻糖含量为1 70.7mg/g,比出发菌株提高了9 9.4%。最后,本研究对诱变菌种的发酵液进行了检测,结果检测出高含量(1“.4mg/g)的海藻糖,与酵母zY一D一10胞内海藻糖量接近,这是本研究的新发现。发酵液中海藻糖是菌体生长过程中代谢产生的,还是菌体死亡后溶出的,还有待于进一步研究.但是,无论是哪一种原因,这一发现都将为海藻糖的生产提供全新的途径。综上所述,本研究在总结以往研究成果的基础上,进行大量的试验和分析,在海藻糖的定量定性检测方面取得了一些突破.同时,试验又对酵母菌进行了诱变处理,筛选出高产菌株,并且首次从酵母发酵液中检测出较高含量的海藻糖,为这领域的下一步研究莫定了良好的基础.……   
[关键词]:海藻糖;定性;定量;酵母;诱变;筛选
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:吉林农业大学2003年