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嗜水气单胞菌β-HemA重组菌的优化培养及其表达产物ISCOMs的制备

方勤美

  嗜水气单胞菌能导致鱼类细菌性疾病并造成大面积流行,给水产养殖业造成巨大的经济损失。嗜水气单胞菌病的免疫预防研究已成为鱼病学研究的热点,国内已开发了嗜水气单胞菌灭活全菌疫苗,其亚单位苗和基因工程苗也正在研究中。溶血素是嗜水气单胞菌重要的毒力因子和保护性抗原,是目前嗜水气单胞菌亚单位苗和基因工程苗研究的重要对象。本研究在构建嗜水气单胞菌β-hemA基因重组菌的基础上,探讨重组菌的优化培养,提高基因产物的表达量,应用基因表达的β-溶血素制备免疫刺激复合物,为嗜水气单胞菌亚单位疫苗奠定技术基础。通过设计正交试验探讨温度、培养基、时间三个因素对嗜水气单胞菌β-hemA重组菌E.coli DH_5。(命名为PCB)基因产物表达量的影响,选择最佳培养条件,实现优化培养,提高了β-hemA基因产物的产量。实验结果表明:该重组菌株在100mLTSB(添加0.05%酵母浸提物,1.8μg/mL ZnCl_2),37℃培养30小时收获,其毒素蛋白含量为3258μg,毒素溶血价为17.44hu/μg,而在LB(100mL)和营养肉汤(100mL)中最高蛋白量和溶血价分别为1260μg,14hu/μg和1199μg,8.22hu/μg。所选择的三个因素中对毒素蛋白质含量影响最大的是培养基,其次是温度;而对溶血作用影响最大的则是温度,其次为时间。最佳生长曲线测定结果表明,在培养基预热至37℃的情况下,PCB 6小时能进入对数期。重组菌PCB培养物经硫酸铵浓度梯度沉淀粗提毒素蛋白质,并在pH2.5的柠檬酸缓冲液里酸化处理以暴露其疏水区,经Mega-10裂解后与Quil A、卵磷脂、胆固醇等结合制备β-hemA-ISCOMs(Immune Stimulating Complexes,ISCOMs),透射电镜下可观察到β-hemA-ISCOMs,呈直径40nm左右的多面体的笼格状颗粒结构。用β-hemA-ISCOMs(以下简称ISCOM组)、β-hemA-CFA(弗氏佐剂,以下简称CFA组)和β-hemA-Free Adiuvant(以下简称FA组)免疫接种鳗鲡,以PBS作为空白对照,免疫保护试验证实,同剂量的ISCOMs组比CFA组和FA组对本菌株TPS-30攻击具有更高的保护率,ISCOMs组可达100%,福建农林大学硕士学位论文CFA组能达87.5%,而FA组只有50%;交叉免疫保护实验证实:鳗鲡经ISCOMs免疫后除了能抵抗本菌株TPS一30的攻击外,还能产生抗异源菌株WQ免疫保护力,其中,IsCOMs组对wQ保护率为100%,未加佐剂组对WQ的保护率仅为33%。淋巴细胞增殖ELISA试验显示,在免疫剂量和Co认刺激剂量均相同的情况下,IsCOMs免疫组淋巴细胞的ELISA OD450比FA免疫组高出0.3。……   
[关键词]:嗜水气单胞菌;β-溶血素;优化培养;生长曲线;ISCOMs免疫
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:福建农林大学2003年