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弹性蛋白酶发酵工艺及其发酵动力学研究

陈启和

  弹性蛋白酶是一种以水解不溶性弹性蛋白为特征的蛋白水解酶,它主要用作治疗高血脂症、防止动脉粥样硬化的生化药物,同时由于其广谱的蛋白水解活性,不仅在医疗上有其应用价值,而且在食品工业、日用化学工业上有着广阔的应用前景和较高的商业价值。本文主要从菌种的选育入手,研究了弹性蛋白酶的发酵技术和发酵工艺,同时构建了分批发酵动力模型。研究了氧载体吐温80在调控细胞生长和弹性蛋白酶合成过程的作用,以及弹性蛋白酶的纯化和酶学性质及酶促反应动力学,最后探讨了弹性蛋白酶在肉类嫩化中的应用效果和作用机理。主要研究结论如下:(1)从土壤中筛选的菌株EL3所产弹性蛋白酶的酶活为60U/ML,发酵24h,经鉴定该菌株为芽孢杆菌。经紫外、微波和硫酸二乙酯复合诱变,突变株EL314CF10的产酶水平明显提高,为出发菌株的2.9倍。葡萄糖、酪蛋白最有利于菌株产生弹性蛋白酶,而麸皮和羽毛粉作为一种廉价的碳源、氮源分别可以取代葡萄糖和酪蛋白。无机氮源不利于细胞生长和弹性蛋白酶的产生。玉米提取物作为生长因子,发现它能极大提高生物量积累和弹性蛋白酶分泌。对获得的最佳单因子-葡萄糖、酪蛋白和玉米提取物进行了最适浓度正交实验,发现三个因子对产酶影响的优先顺序是:酪蛋白>葡萄糖>玉米提取物,三因子的优化水平组合为4%葡萄糖、2%酪蛋白和0.5%的玉米提取物。装液量影响弹性蛋白酶的产生反应出溶氧对细胞生长和产物合成的显著影响。(2)用响应面优化方法对种子培养基进行了优化,牛肉膏和酵母膏对种子的生长影响尤为显著,而氯化钠和蛋白胨对种子的影响不是很明显。对发酵培养基进行了系列优化,得到了优化后的培养基组成为(g/L):葡萄糖74.0,酪蛋白11.30,玉米提取粉6.16,磷酸氢二钾2.06,硫酸镁0.34,pH7.5,与部分优化的培养基相比,全优化培养基能明显提高生物量的积累和弹性蛋白酶的分泌;外加无机盐和表面活性剂、大分子聚合物影响着菌体生长和弹性蛋白酶合成,结果揭示钙离子能在一定程度上可以提高弹性蛋白酶活,但提高幅度不大;低浓度的Tween-80能显著改善酶的分泌和细胞生长,0.1%的SDS对细胞生长和弹性蛋白酶合成的影响是完全不一致的。高浓度的聚合物中只有0.1%的胶原蛋白能显著提高细胞的生长和弹性蛋白酶的积分泌,而其它聚合物对菌体生长和酶分泌存在一定的抑制或促进作用不明显;对两种培养基发酵生产弹性蛋白酶的发酵过程比较可以看出,全优化后的培养基无论是对细胞生长还是对弹性蛋白酶合成都有着明显的促进作用。浙江大学博士学位论文(3)采用部分因子设计和中心组合设计对培养条件进行了筛选和优化,影响细胞生长和弹性蛋白酶产生的主要因子是培养时间和摇床转速,两个因子对弹性蛋白酶合成和细胞生长的影响是不一致的,并获得了摇瓶发酵下较优的发酵条件为:220r/min,25h,此时模型预测的最大响应值为434U/ml。探讨不同培养温度下细胞生长、底物消耗和产物合成发现,37℃下培养更有利于弹性蛋白酶合成,35℃下细胞的比生长速率要明显高于37℃添加弹性蛋白能明显提高生物量的积累,但对产物合成提高不明显。同时对不同添加时间进行了研究,发现所试验的两种时间下,弹性蛋白对弹性蛋白酶合成和细胞生长的调控效果是完全不同。细胞生长过程中存在比较明显的波动现象。首先分析了玉米提取物对生长的影响,玉米提取物是细胞生长和弹性蛋白酶合成的必需因子,无论添加与否,菌体生长过程中都出现了比较明显的波动;摇瓶发酵和罐发酵的数据相结合探讨了菌体生长波动现象的原因。实验结果显示无论是采用摇瓶还是5一L罐作为发酵体系,细胞生长波动的本质并没有改变。SDS一PAGE分析了不同发酵条件和发酵方法下胞外蛋白质的变化,从电泳的蛋白质条带数量上似乎并不能很好解释细胞生长波动的原因。(4)研究了芽抱杆菌EL3 14CFIO的分批发酵工艺和发酵动力学,芽抱杆菌EL3 14CF10生产弹性蛋白酶的发酵类型可能属于生长部分关联型。4%的葡萄糖浓度更有利于底物代谢,菌体生长速度要快,但最大生物量和弹性蛋白酶分泌水平没有7.4%的高,因此可以考虑在发酵过程中采取流加碳源来解除过高葡萄糖浓度对生长比速率抑制。一定范围内提高搅拌转速能加快底物的转化和菌体的生成,有利于弹性蛋白酶的分泌,尤其是前期的通气量对发酵影响尤为显著。发酵中的溶解氧是指导发酵过程的一个非常重要参数,可以将它作为发酵放大的依据。用Logistie方程、Leudeking一piret方程不[1 Leudeking一Piret一Like方程分别描述细胞生长、产物合成和弹性蛋白酶合成的动力学规律,动力学模型如下:击丁=0.44(1一云)x‘召了丝一35150竺一45二dtdt一塑一3 .01竺十o.o6xdtdt浙江大学博士学位论文对三个动力学模型参数的检验结果也可以显示,所建立的菌体生长和底物消耗的动力学模型可以很好地解释实际发酵中细胞生长、底物代谢的过程。在转速400r/min,ZL/min通气量下发酵30小时弹性蛋白酶分泌水平达到近350U/ml。(……   
[关键词]:芽孢杆菌EL314CF10;弹性蛋白酶;响应面优化;分批发酵动力学;流加发酵;波动生长;纯化和性质
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:浙江大学2003年