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水稻内生细菌的研究及其杀虫工程菌的构建

孙惠青

  本研究从四川主要栽培水稻品种D优527体内共分离到102株细菌。研究了内生细菌在水稻植株内不同生育期、不同组织部位的动态分布曲线特点,确定编号为SR-15、SR-25、SL-37的三株细菌为优势菌株,并进行了优势菌株的回接、定殖试验,验证其内生性。经生理、生化特性结合形态学的研究,确定了优势内生菌株在微生物学上的分类地位,并进行了与Bt杀虫蛋白基因的重组,以及杀虫蛋白基因的表达及对水稻二化螟防治研究,验证了优势内生细菌作为生防工程载体菌的可行性。此外,对菌株的致病性、促生性等生物学特性进行研究。取得的主要结果如下:1 利用改进的细菌分离技术,从健康栽培水稻品种D优527的植株体内共分离到102株细菌,从根系中分离到41株,从叶片分离到37株,从茎分离到24株。其中,革兰氏阳性细菌77株,革兰氏阴性细菌25株。利用ERIC-PCR技术对菌株基因组进行分析,结果显示,菌株基因组间存在多态性。2 对所获得菌株进行种群、数量的动态分析,研究细菌在根、茎、叶内随水稻生育期变化的动态分布情况,其中,水稻分蘖期和孕穗期是细菌种群数量分布的高峰时期。3 根据种群分布特点,初步确定SR-15、SR-25、SL-37为优势种群,而SR-15优势性尤为明显,并确定了SR-15、SR-25、SL-37菌株在不同生育期数量动态变化趋势,其中,SR-15在分蘖期和孕穗期数量分布高于其它两菌株。4 对SR-15、SR-25、SL-37菌株的生物学特性进行研究,结果显示,菌株的生长均符合细菌生长的典型的生长曲线,在不同pH、温度、培养基条件下,菌株生长的动态变化各有差异,且与相关报道的内生细菌生长特性具有一定的相似性。5 转puc18标记验证内生性试验结果表明,在不同电压下,电击转化细菌的效率不同,在电压为1500V时转化效率最高,而puc18使用量对转化效率影响不明显。转带抗生素标记的puc18于优势细菌,回接水稻再分离,在抗生素培养基上初步筛选和PCR鉴定,与原始菌株一致。并通过电子显微镜超薄切片确定了各菌株在水稻体内的存在部位。验证了SR-15、SR-25、SL-37皆为水稻内生细菌。6 对SR-15、DR-25、SL-37菌株进行光学显微镜和电子显微镜观察、细胞壁化学成分分析以及生理生化特性分析,确定SR一巧为盐敏芽抱杆菌,SR一25为栖息微球菌,SL一37为浅黄金杆菌。8应用改进的PEG原生质体转化法和新型高效电击转化法,将含杀虫毒性强的苏云金杆菌6一内毒素基因Cry 1 Ac的质粒导入载体菌SR一15,构建杀虫工程内生细菌,并用电镜观察到基因表达后产生的毒蛋白晶体。9工程菌株的杀虫试验表明,经超声波破碎后工程菌株发酵液(loscfi对ml一1护cfiUml)浸水稻幼苗,并饲养水稻二化螟幼虫,6天后其校正死亡率达80.1%。……   
[关键词]:内生细菌;优势种群;ERIC-PCR;回接验证;重组
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:四川农业大学2003年