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猪源致病性大肠杆菌gyrA基因喹诺酮耐药决定区的单链构象多态性分析

吴祥辉

  本研究对猪源致病性大肠杆菌氟喹诺酮药物的耐药性测定结果表明,142株猪源致病性大肠杆菌对环丙沙星(CIP)、恩诺沙星(ENR)、诺氟沙星(NOR)、氧氟沙星(OFL)耐药率分别为78.8%、56.3%、65.5%、76.8%,且交叉耐药率在70.5%以上。猪源致病性大肠杆菌对氟喹诺酮类药物产生了广泛的耐药性。采用浓度梯度递增法对敏感大肠杆菌进行环丙沙星耐药性诱导,WJPE3-2、MYPE1-4、MSPE6、WJPE2-1四株敏感大肠杆菌株均获得了诱导耐药菌株,对CIP的MIC值分别为诱导出发菌株的4、32、32、256倍。诱导菌株对喹诺酮类另外三种药物的耐药性也增加,表明大肠杆菌对喹诺酮药物的耐药性可以在一定浓度药物作用下通过诱导产生。本研究PCR扩增猪源致病性大肠杆菌和诱导耐药菌株gyrA基因的喹诺酮耐药决定区(QRDR),均获得特异的约300bp的产物。比较研究了聚丙烯酰胺凝胶交联度和浓度、甘油添加量等影响SSCP分析的因素,建立了检测gyrA基因喹诺酮耐药决定区PCR产物的银染SSCP方法,即1296的聚丙烯酰胺(Arc∶Bis=29∶1)凝胶,胶中添加5%的甘油、1×TBE电泳液、20mA、4℃下恒温电泳10~12h后硝酸银溶液染色。本研究对WJPE2-1及其药物浓度梯度连续递增培养获得的诱导菌株INDUCED-1,2,3,4 gyrA基因QRDR的PCR产物的进行了测序,诱导菌株与WJPE2-1PCR序列均存在差异,但INDUCE-1,2序列相同,INDUCE-3,4序列相同。GenBank注册号分别为:AY323805,AY323806,AY323807。采用建立的方法,对诱导菌株PCR产物进行SSCP分析,PCR产物SSCP结果均与标准敏感对照不同,测序显示诱导耐药菌株QRDR在第83位(t(?)g-ttg)、87位((?)ac-tac)发生碱基变换,测序结果与SSCP检测结果相符。采用建立的银染PCR-SSCP方法检测不同药敏性的27株猪源大肠杆菌中,7株敏感大肠杆菌中有6株的SSCP分析结果与标准敏感菌一致,符合率为85.7%;20株耐药大肠杆菌中18株的SSCP结果与标准敏感菌不同,突变检出率为90.0%。PCR-SSCP对猪源大肠杆菌gyrA基因QRDR的分析,有较高准确性。……   
[关键词]:大肠杆菌;氟喹诺酮;药敏试验;诱导耐药;gyrA;QRDR;SSCP
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:四川农业大学2003年