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丁酰胆碱脂酶基因纳米粒的研究

周旭

  在药剂学中,使用高分子材料,用适当的方法制备的微粒制剂已经得到广泛而深入的研究,并取得一定的成果。纳米粒递送系统是指具有超微小尺度的、携带具有生物活性成分的粒子,粒径范围在1—1000nm。当前,纳米粒作为非病毒性基因递送载体成为研究热点。一般认为纳米粒子包裹基因后,能够增强基因在体外的稳定性,防止体内核酸酶的降解,对基因起到保护作用,增加基因进入目的细胞的数量,提高基因转染效率,使其更有效地表达出所需要的目的蛋白。本研究选择了绿色荧光蛋白质粒基因(pIRES2_EGFP)和丁酰胆碱酯酶质粒基因(pRcCMV-BchE)作为模型基因药物,在前面研究的基础上,用绿色荧光蛋白质粒基因(pIRES2_EGFP)重点考察表面修饰、转染效率,用丁酰胆碱酯酶质粒基因(pRcCMV-BchE)优化纳米粒制备工艺、考察纳米粒理化性质、并对其体外转染效率以及体内递送进行了初步研究。采用复凝聚法制备了丁酰胆碱脂酶基因-壳聚糖纳米粒,考察了壳聚糖浓度、质粒基因浓度、硫酸钠浓度、体系的pH值和涡旋混合时间等对纳米粒粒径的影响,结果表明:一定条件下,随着壳聚糖浓度的增大,平均粒径减小;随着基因浓度的增大,平均粒径增大;硫酸钠浓度、体系的pH值以及混合时间的变化,军事医学科学院硕士学位论文丁酸胆碱脂酶基因纳米粒的研究中文摘要对粒径大小影响不显著,壳聚糖与基因之间的相互作用,对粒径具有非常显著的影响。经过筛选优化的纳米粒制备条件是:壳聚糖浓度300μg/mL、质粒基因浓度100μg/mL、硫酸钠浓度5mM,pH值5.5,涡旋混合时间30秒。在优化的纳米粒制备工艺条件下,研究了丁酞胆碱脂酶基因纳米粒的理化性质。用透射电镜和扫描电镜观察了粒子形态和大小,用纳米粒度分析仪(PCS)测量粒径、多分散度、Zeta电位等指标,用荧光光谱法测定纳米粒的载药量和包封率。所制得的纳米粒总平均径、强度平均径、体积平均径、数目平均径、多分散度和ZETA电位,结果分别为218.1nm、238nm、421.9nm、69.7nm、0.291、+15.gmV。粒径分布测定图和多分散度数值表明:壳聚糖纳米粒的粒径分布范围较窄,绝大多数粒子粒径在loonln以下。Zeta电位测定结果表明,基因壳聚糖纳米粒表面带有正电荷,电荷之间的排斥作用对粒子稳定性有利。丁酞胆碱脂酶基因纳米粒的载药量和包封率分别为38.52%、98.64%。包封率大于98%,说明质粒基因几乎全部成粒子,纳米粒混悬液中剩余基因很少,证明制备工艺具有可行性。载药量可达38%以上,证明壳聚糖包裹基因的能力比较强。为了提高纳米粒体系的稳定性和靶向性,本文对基因壳聚糖纳米粒进行PEG化修饰并在其表面连接肝实质细胞靶向配基---一半乳糖基牛血清白蛋白。用透射电镜对PEG化纳米粒和进一步连接半乳糖基牛血清白蛋白的纳米粒进行观察,结果表明:经冷冻干燥后,表面修饰纳米粒在水中的重分散性良好,纳米粒形态没有显著变化。纳米粒PEG化和连接糖蛋白,对粒径大小没有显著影响。利足体外基因转染评价了壳聚糖纳米粒的基因递送能力,选择人胚胎肾细胞和肝癌细胞进行体外转染实验,系统考察了细胞培养时间、基因递送剂量、表面修饰情况以及不同基因类型等对转染效果的影响。结果表明:细胞培养三天左右、递送基因剂量在4pg左右转染效果较好,纳米粒表面连接PEG对转染有利,当在PEG化纳米粒表面继续连接蛋白配基时,转染效果反而会有所下降。本文对pRc/C Mv一BChE一壳聚糖纳米粒的小鼠体内基因递送进行了初步研究。实验结果表明:在10阳/209小鼠体重的给药剂量下,随着时间增加,小鼠血浆内的BChE含量从给药后第3天开始逐渐增加,在第6天BChE含量可以达到原来水平的两倍,此后进入稳态。随着给药剂量增加,小鼠血浆内BChE含量逐渐增2军事医学科学院硕士学位论文丁酸胆碱脂酶基因纳米粒的研究中文摘要加,在10林g/209给药剂量下,小鼠血浆内BChE含量达到较高水平,此后在考察时间段内,进入相对的稳态。以上实验结果表明壳聚糖纳米粒的体内基因递送研究取得一定成功,证明壳聚糖纳米粒用于体内基因递送具有技术可行性。本文的研究结果表明,纳米粒基因递送载体值得深入研究,利用药剂学中纳米控释制剂的研究成果,加快纳米粒作为非病毒性基因递送载体研究的步伐。……   
[关键词]:壳聚糖;质粒;丁酰胆碱醋酶;绿色荧光蛋白;转染;PEG;半乳糖基牛血清白蛋白;纳米粒
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:中国人民解放军军事医学科学院2003年