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登革病毒NS5蛋白在原核细胞中的活性表达及其拮抗肽筛选

王明连

  登革病毒(DEN)是黄病毒科的重要成员,分4个血清型,均可引起登革热、登革出血热和登革休克综合征,广泛流行于世界100多个国家和地区。人群对任何一型登革病毒的初次感染均较敏感,感染后获得对同型病毒比较持久的免疫力,对异型病毒的免疫力很短暂,因而感染1个型别后还可能发生第二次或连续感染,且易产生抗体依赖的感染增强效应(ADE),ADE是引起登革出血热和登革休克综合征的主要原因,也是疫苗研究中的一大障碍。目前尚无有效的抗DEN制剂或先导物质的报告,亦无被批准的疫苗。DEN NS5蛋白是病毒基因组编码的最大的蛋白,分子量104×10~3。近年来的研究表明,NS5蛋白具有RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)功能,即可以识别具有相对特异性的模板RNA并与之结合,合成与模板互补的RNA链,在病毒基因组复制过程中起关键作用。鉴此,NS5可以成为阻断或抑制病毒复制的靶标,而目前国内外尚无以DEN NS5作为抗病毒靶标的研究报告。本研究旨在建立DENNS5蛋白表达体系,获得具有RdRP活性的重组表达产物;以NS5蛋白为靶分子,筛选相应的小分子结合肽,期望从中获得具有RdRP活性抑制作用的先导物。研究工作分以下三个部分:(1)DEN NS5表达体系的构建:自DEN感染组织中提取总RNA,RT-PCR获得含NS5基因的DNA,将NS5基因插入pQE30载体中,测序证实编码基因插入正确。将表达质粒转化E coli.XL1-Blue,获得XL1-Blue/NS5菌株。经SDS-PAGE和Western-blotting证实,将XL1-Blue/NS5增菌培养后更换培养基,在新的培养基中诱导,可以获得带有6xHIS标签的NSS蛋白的表达。在较低温度下诱导,可以获得NSS蛋白的可溶性表达。用Ni一NTA树脂亲和纯化表达产物,经过梯度漂洗和洗脱,获得纯度90%以上的全长表达产物,另有6.5%的非全长翻译产物(约70KDa)。该部分工作是整个研究工作的瓶颈,是最为基础和关键的一步。所采用的培养条件对于其他大分子蛋白的表达可能也有一定的借鉴意义。(2)重组NSS蛋白RdRP活性和抗原性的分析:通过RT一PCR分别获得DEN基因组5’末端区(TR)和3‘一R的cDNA片段,将两片段连接,形成两端与原病毒基因组TRs序列相同的亚基因组DNA。经转录反应获得DEN亚基因组RNA,即为DEN RdRP可特异识别的模板RNA。参照国外己建立的细胞提取复合物的RdRP活性反应体系,建立了细胞外NSS蛋白的RdRP反应体系,并对RdRP反应产物进行RNaseA敏感性实验。重组NSS蛋白的Rd即反应和反应产物的 RNaseA敏感性实验表明,所得重组NSS蛋白具有良好的RdRP活性,能以亚基因组RNA为模板合成与之互补的RNA,新生链是与模板链相结合的双链形式存在于Rd即反应体系中。本部分研究工作还通过Western一blotting和ELISA实验分析了重组NSS蛋白的抗原性,实验表明,重组NSS蛋白与DEN全病毒免疫血清间有良好的特异反应性,提示DEN NSS蛋白具有免疫原性,可以刺激宿主的免疫机制激发免疫反应,NSS抗体的中和保护作用值得研究;同时表明,重组NSS蛋白具有良好的免疫反应性,对于DEN感染有一定的诊断意义。(3) NSS蛋白小分子结合肤的筛选:以活性表达的NSS蛋白为配基,从噬菌体展示的构象约束性随机肤库中筛选相应的配体分子,共进行了4轮筛选。选取第4轮洗脱噬菌体的20个克隆,扩增后提取单链噬菌体DNA,对噬菌体Pm基因中的插入片段进行测序。通过比较插入片段氨基酸序列的共性,自噬菌体展示肤库中筛选出2组可与DEN NSS蛋白特异结合的环7肤分子,ELISA实验证实所得噬菌体克隆与靶蛋白间具有特异亲和力。自2组结合肤中各选择1个环肤分子用化学方法合成,将合成肤加入RdRP反应体系后,其中1个环肤分子对RdRP活性表现明显的拮抗作用,加入细胞培养中可对DEN感染细胞产生明显的保护作用。……   
[关键词]:登革病毒;NS5蛋白;RNA依赖的RNA聚合酶;噬菌体肽库;小分子多肽;拮抗肽
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:中国人民解放军军事医学科学院2003年