手机知网 App
24小时专家级知识服务
打 开
手机知网|搜索

监测海水有机磷农药的生物传感器研制

朱小山

  目前,农林业广泛使用的有机磷农药对海洋生物危害巨大,已经对海水养殖业形成威胁。为了控制海水有机磷农药的污染程度,减少渔业损失,我国现行的《海水水质标准(GB 3097-1997)》和《渔业水质标准(GB 11607-89)》都对水体中马拉硫磷、甲基对硫磷等有机磷农药的浓度作了严格限定。然而,仅有标准还不足以有效控制有机磷农药的污染水平,重要的是对有机磷农药进行快速灵敏的监测。近年来,人们更多地把注意力集中到具有高选择性、高灵敏度、较好的稳定性、低成本、能在复杂的体系中进行快速在线连续监测的生物传感器上。生态毒理学研究表明,有机磷农药的毒性作用主要归因于对动物乙酰胆碱酯酶[acetylcholinesterase,AChE(EC 3.1.1.7)]的抑制,而且在一定条件下,AChE的活性变化与有机磷农药的浓度存在良好的相关性。这正是制作AChE酶传感器监测有机磷农药的理论基础。此外,已经知道不同生物来源的AChE对有机磷农药具有不同的敏感性,因此,为了灵敏监测海水中微量有机磷农药,有必要对不同生物来源的AChE进行筛选。鱼类被认为是水生生态系统中对有机磷农药较为敏感的一类动物。目前,已有许多报道采用鱼脑AChE作为检测水体有机磷农药污染程度的指示酶。同时,鉴于海水高盐度的特性,生物传感器应以海洋动物的AChE为酶源。所以,本文以10种海洋鱼类:鲈鱼(Lateolabrax japonicus)、黄鱼(Hexagrammos otakii,)、美国红鱼(Sciaenops ocellatus)、真鲷(Pagrosomus major)、黑鲷(Sparus macrocephalus)、鲅鱼[Scomberomorus niphonius(Curier)]、面包鱼[Navodon septentrionalis(G ü nther)]、鳗鲡[Anguilla japonica(Temminck et Schlegel)]、黑头鱼[Sebastodes fuscescens(Houttuyn)]和黄花鱼[Pseudosciaena polyactis(Bleeker)]为实验材料,采用半抑制浓度(IC_(50))和双分子速率常数(K_i)为指标,通过体外抑制作用比较了这10种海鱼脑AChE对马拉硫磷和甲基对硫磷的敏感性。实验发现:这10种海鱼的脑组织AChE的基础活性在4.62~35.65μmol/min/g之间,面包鱼的酶活性最高,黄花鱼的酶活性最低。对马拉硫磷,由IC_(50)所得到的AChE敏感性为:鲅鱼、黄鱼、鲈鱼、真鲷>黑鲷>黑头鱼、鳗鲡>美国红鱼、黄花鱼>面包鱼;由K_i所得到的AChE敏感性为:鲅鱼>黄鱼、鲈鱼、真鲷>黑鲷、黑头鱼、鳗鲡>美国红鱼、黄花鱼、面包鱼。对甲基对硫磷,由IC_(50)所得到的AChE敏感性为:鲅鱼>鲈鱼>黄鱼、黄花鱼、真鲷、黑鲷、黑头鱼、鳗鲡>美国红鱼>面包鱼;由K_i所得到的AChE敏感性为:鲅鱼>鲈鱼、黄鱼、黄花鱼、黑鲷、黑头鱼、鳗鲡>真鲷>美国红鱼>面包鱼。鲅鱼、鲈鱼和黄鱼对这两种有机磷农药都较为敏感。另外,鱼脑AChE活力的抑制作用与水体中的有机磷农药具有良好的剂量—效应关系。在1~50mg·L~(-1)浓度范围内,两者间呈现较好的线中国海洋人学硕卜论文:监测海水有机磷农药的生物传感器研制—敏感酶的筛选、纯化,J固定技术研究性相关性,其相关系数基本上都在0.93以上。根据AChE的敏感性及其对有机磷农药的线性响应程度,黄鱼和妒鱼脑AChE分别适于作为监测马拉硫磷和甲基对硫磷的指示酶,而鱿鱼脑AChE对两种有机磷农药都适用。在筛选得到敏感酶的基础上,采用亲和层析法对鱿鱼脑组织的AChE进行分离纯化,然后对其进行底物特异性、过量底物抑制效应和抑制剂选择性检验。结果证实该酶为AChE,其最大比活力为297.82林moL/min/mg,最佳pH范围在7.0一8.0之间,最佳温度为30℃。该酶经SDS一PAGE呈一条带,表明其纯度达电泳纯。在海水背景下,进一步探讨了纯化酶(游离状态)指示海水中有机磷农药微污染的可行性。实验表明,在抑制时间为20min时,马拉硫磷和甲基对硫磷对鱿鱼脑AChE的半抑制浓度分别为1 .26 X10一,mol·L一’(4 .1 54 mg·L一l)和o.50xlo一5m。比一’(l .168 mgL一’)。鱿鱼脑组织的AchE对马拉硫磷和甲基对硫磷均较为敏感。实验还发现,在一定浓度范围内,AChE活力对有机磷农药表现出显著的线性响应。这提示,跋鱼脑组织的AChE可以作为监测海水有机磷农药酶传感器的敏感材料。制备酶传感器的关键技术是酶的固定化,它影响到酶活性的保持和传感器的稳定性。本研究首次以普鲁卡因胺(procainamide)为吸附剂、多孔琼脂珠为载体,制备固定化的跋鱼脑组织AChE。酶活力测试发现,该固定化酶具有很高的催化活力和较好的稳定性,酶活回收率达88%。PH稳定性和热稳定性的研究结果表明,经过固定后,酶的最佳PH值范围变化不大,但其最适温度范围变宽,热稳定性提高。以该固定化酶为识别元件,以PH电极为换能器,构建流动注射型乙酞胆碱醋酶传感器。该传感器具有良好的重现性(RSD=1 .427%,n=10),可实现对有机磷化合物的在线监测,对甲基对硫磷具有线性响应的浓度范围为4.29 x 10.’“-4.29 x 10一8 mol·L‘’(或0.1,g·L一‘一1009·L一’),最低检测限为l.3xlo一,omol·L.I(或0 .03 09·L一,).……   
[关键词]:鲅鱼;乙酞胆碱脂酶;有机磷农药;纯化;固定化酶;生物传感器
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:中国海洋大学2003年