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中国对虾(Penaeus chinensis)酚氧化酶的生物化学性质及几种免疫促进剂对中国对虾酚氧化酶和血细胞的影响

汪小锋

  中国对虾(Penaeus chinensis)酚氧化酶是中国对虾非特异性免疫系统中的主要成员,在对虾免疫防御中起着关键性作用。对酚氧化酶的研究,对于弄清酚氧化酶的精确生物化学性质,进而确定其在对虾免疫防御中的生物学功能及其作用机制具有重要意义。本文以中国对虾(Penaeus chinensis)的血淋巴为材料,利用凝胶过滤和离子交换等方法,对酚氧化酶(phenoloxidase)进行了分离纯化和生物化学性质研究。实验发现,酚氧化酶原(prophenoloxidase)的分子量为87.5kDa左右,在实验操作过程中极易发生降解或自身降解,变成有活性的大小约77kDa的酚氧化酶,1%SDS可使该酶原全部被激活而成为有活性的酚氧化酶。以L-二羟苯丙氨酸(L-DOPA)为特异性底物对酚氧化酶活性进行研究发现,其最适pH值为6.0左右,最适温度为40℃,K_m值约为1.99mmol/L。利用多种氧化酶抑制剂对酚氧化酶纯化样品的酶活性进行研究,发现抗坏血酸(ascorbic acid),半胱氨酸(cysteine)和二硫苏糖醇(dithiothreitol)对酚氧化酶活性具有很强的抑制作用,硫脲(thio urea)对酚氧化酶活性也具有较强的抑制作用,而酚氧化酶对苯甲酸(benzoic acid)、柠檬酸(citric acid)和亚硫酸钠(sodium sulfite)不敏感,而且该酶对酪氨酸等单酚还具有高特异性的酚氧化酶活性,表明它可能是一种酪氨酸酶型的酚氧化酶;利用各种蛋白酶抑制剂对其性质进行研究发现,该酶的活性为SBTI、Bestatin、p-APMSF和chymostatin等蛋白酶抑制剂较强抑制,但几乎不受PMSF、pepstatin、leupeptin、TLCK和TPCK等的影响,表明该酶在蛋白酶性质上很象是一种胰蛋白酶类型的蛋白酶。此外,该酶对EDTA和金属离子非常敏感,其活性能被Cu~(2+)强烈抑制,被Mg~(2+)强烈激活,并且Cu~(2+)能有效的回复被DETC抑制的酶活,表明该酶很可能是一种Cu-金属酶(Cu-metalloenzyme)。许多免疫促进剂均具有提高动物自身免疫力的功能,能增强被刺激动物抵御外来病原侵袭的能力。在对虾中也已报道了一些免疫促进剂,能不同程度地提高对虾的自身免疫力,但其具体作用机理目前还不清楚。筛选出高效的免疫促进剂,查清其增强对虾自身免疫力的分子机制,不仅具有重要的理论意义,中国对虾酚氛化酶的生物化学性质及几种免疫促进剂对对虾酚氛化陇和血细胞的影晌而且对于利用免疫促进剂增强对虾免疫力、降低死亡率,促进对虾养殖业的可持续发展,还具有重要的应用价值。本文利用脂多糖(LPS)、p一葡聚糖(p一1,3一glucan)、灭活哈维氏弧菌和灭活鳗弧菌4种免疫促进剂对中国对虾进行了免疫刺激,通过分离纯化、光镜和透射电镜观察等技术对刺激前后中国对虾酚氧化酶的产量、活性以及血细胞的数量、超微结构的变化进行了研究。研究结果表明,经p一葡聚糖刺激后的中国对虾,其血细胞总数量增多了83.4%,其中小颗粒细胞的数量增多了100.4%,酚氧化酶的产量提高了104.7%,总酶活性提高了79.4%,而单位酶活性并无变化(实验组/对照组,0.99);经LPS刺激后的中国对虾,其血细胞数量增多了52.0%,其中小颗粒细胞数量增多了673%,酚氧化酶的产量提高了81.3%,总酶活性提高了113.1%,单位酶活性几乎没有变化(实验组/对照组,1.04);经灭活哈维氏弧菌刺激后的中国对虾,其血细胞数量增多了73.4%,其中小颗粒细胞数量增多了572%,酚氧化酶的产量提高了30.1%,总酶活性提高了37.8%,单位酶活性基本上没有变化(实验组/对照组,1.06);经灭活鳗弧菌刺激后的中国对虾,其血细胞数量增多了1 n.3%,其中小颗粒细胞数量增多了102.9%,酚氧化酶的产量提高了40.4%,总酶活性提高了46.3%,单位酶活性几乎没有变化(实验组/对照组,1.04)。透射电镜下的观察结果表明,中国对虾血细胞的超微结构在免疫刺激前后也发生了变化,三种血细胞的糙面内质网、核糖体和线粒体的数量均有一定程度的增加,其中以小颗粒细胞和大颗粒细胞的超微结构变化幅度最大。从以上研究结果可得出如下结论:免疫促进剂刺激后,免疫刺激所引起的血细胞数量的增加主要是小颗粒细胞数量的增加(小颗粒细胞数量占血细胞总量的85.3%),证明小颗粒细胞在免疫促进剂的作用发挥中具有至关重要的作用;免疫促进剂刺激后,酚氧化酶产量增加,总酶活性提高,而单位酶活性基本上没有变化,从而证实中国对虾在接受免疫刺激后主要是通过增加酚氧化酶的产量而不是通过提高酚氧化酶的单位酶活性来增强自身免疫力的;综合几种免疫促进剂对中国对虾酚氧化酶产量及血细胞尤其是小颗粒细胞数量、结构的影响,发现脂多糖和p一葡聚糖在四种免疫促进剂中的效果最好,可望应用于对虾养殖业中以降低对虾的死亡率。……   
[关键词]:中国对虾;酚氧化酶;酪氨酸酶;金属酶;免疫促进剂
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:中国海洋大学2002年