手机知网 App
24小时专家级知识服务
打 开
手机知网|搜索

栉孔扇贝(Chlamys Farreri)血细胞及其免疫特性的研究

邢婧

  用四种方法对栉孔扇贝的血细胞进行了分类,将其分成两类:透明细胞和颗粒细胞。以吉姆萨染色法光镜观察,两种细胞都被染成紫红色,透明细胞无颗粒,细胞核圆形,居中,细胞质较少,核质比大。颗粒细胞比透明细胞大且多,染色深,但核质比小,在细胞质中有颗粒,有些颗粒细胞具双核。电镜观察,透明细胞几乎不含细胞器,常染色质丰富。颗粒细胞有少量的细胞器,细胞质电子密度高,颗粒有膜包围,细胞有伪足。双核颗粒细胞的两个核在形态上相同。密度梯度离心,透明细胞主要位于上层,颗粒细胞则大部分位于下层。流式细胞仪根据血细胞的大小和颗粒,经正、侧光散射参量分析,也将血细胞分为透明细胞和颗粒细胞。免疫细胞化学方法定位过氧化物酶(POD)、酚氧化酶(PO)、碱性磷酸酶(ALP)。以DAB为底物发色,两类血细胞的细胞质中都显示POD活性,POD阳性率为49.3%,其中透明细胞占18.6%,颗粒细胞占30.7%;不同类型的血细胞POD阳性率不同,透明细胞的POD阳性率(HPR)为39%,颗粒细胞POD的阳性率(GPR)为47%。以多巴胺(L-DOPA)为底物发色,两类血细胞都能观察到PO阳性,瑞氏染色复染结果,PO阳性率为37.5%,其中透明细胞占13.4%,颗粒细胞占24.1%;两类血细胞的PO阳性率不同,透明细胞的PO阳性率为32%,颗粒细胞的PO阳性率为40%。以NBT和BCIP为底物发色,血细胞ALP阳性率为40.1%,其中透明细胞占16.3%,颗粒细胞占23.8%;两类血细胞的ALP阳性率不同,透明细胞的ALP阳性率为50%,颗粒细胞的ALP阳性率为61%。生物化学方法测定POD、PO、ALP酶活性。参照辣根过氧化物酶活性的标准曲线计算,透明细胞POD活性为2.4 ng/ml,颗粒细胞POD活性为3.9ng/ml;以多巴胺为底物测得两类血细胞PO活性分别为:透明细胞9个单位,颗粒细胞14个单位;以pNPP为底物,透明细胞的ALP活性为3.0u/l,颗粒细胞的为20.9u/l。免疫细胞化学方法和生化活性测定两种方法结果表明颗粒细胞中这三种酶的活性均强于透明细胞。NBT法测吞噬力,经瑞氏染色后,血细胞NBT阳性率53.7%,其中透明细胞为18.2%,颗粒细胞为35.5%;两类血细胞抗菌活力的测定结果表明:中国海洋大学博十学位论文透明细胞的Ua为0.196,颗粒细胞的为0.385;两类血细胞溶菌活力的测定结果表明:透明细胞的UL为0.122,颗粒细胞的为0.262;两类血细胞分别与不同浓度梯度的菌悬液混合,颗粒细胞活性氧的产生大于透明细胞。而且,活性氧的产生都随细菌浓度的增加而增加,当细菌浓度达到108cell/ml时,两类血细胞活性氧的产生都高于其它稀释梯度。按溶菌酶标准曲线对照,颗粒细胞的溶菌酶活力为2.78 mg/L,透明细胞的为0.80 mg/L。颗粒细胞吞噬力、抗菌活力、溶菌活力及活性氧产生均强于透明细胞。以栉孔扇贝血细胞作为抗原免疫Balb\c小鼠,取出脾脏,聚乙二醇为融合剂,将免疫小鼠的脾细胞和P3一X63一Ag8UI小鼠骨髓瘤细胞融合,用日本进口完全细胞培养基GIT培养杂交瘤细胞。应用免疫荧光抗体技术(IFAT)检测杂交瘤上清液,检测得到大量阳性杂交瘤细胞,选取其中20株具有较高分泌能力的杂交瘤细胞冻存备用。有限稀释法克隆了4株阳性杂交瘤细胞(IE7,IF12,2C6,2H5),把梯度离心分成的透明细胞和颗粒细胞血细胞分别与4株单抗进行荧光抗体实验,发现:这4株单抗与透明细胞和颗粒细胞都有不同程度的阳性反应;免疫酶标抗体(AP)检测与扇贝血细胞的反应,单抗IE7与颗粒细胞质的反应阳性,单抗2H5与颗粒细胞的细胞质反应阳性,单抗2C6与透明细胞和颗粒细胞的细胞质反应阳性,单抗IF12与透明细胞和颗粒细胞的细胞质和细胞膜反应阳性。流式细胞仪分析结果,四株单抗与两类血细胞都有不同程度的反应。四株单抗与血细胞反应的阳性率分别为:单抗IE7 54.23%,其中颗粒细胞为39.3%,透明细胞14.93%;单抗IF12 38.56%,其中颗粒细胞为24.7%,透明细胞13.86%;单抗2H5 46.40%,其中颗粒细胞为38.6%,透明细胞17.8%:单抗2C6 79.7%,其中颗粒细胞为75.6%,透明细胞4.1%,该株单抗主要与颗粒细胞结合。western一blotting分析与四株单抗结合的抗原决定簇的分子量,单抗1 E7,2C6分别与分子量为200 kD,60kD的血细胞蛋白结合,单抗2H5没有与之相结合的蛋白带,单抗IF12与血细胞的三条蛋白结合分子量分别为70 kD,60 kD,45kD。组织切片,H.E染色观察,在闭壳肌、消化盲囊、肾等处均发现有囊状组织,有一层致密的结缔组织薄膜,内部多层血细胞,并且形态多样,内有栉孔扇贝血细胞及其免疫特性的研究大的腔,组织中的血细胞比循环血细胞小,形态多样,呈现为圆形、柱形、梭形,并且均紧密的相互挤压在一起,在不同组织附近该组织形态稍有变化,有的呈心形、有的呈椭圆形,并且随着贝壳长的增加,该组织变化不大。在较小的扇贝中,该囊状组织尤其膨大突出,其内壁血细胞密布层叠,分裂增生,靠近闭壳肌侧,有管道相通,并向闭壳肌等器官不断输送成熟的血细胞,并随着扇贝的增大该组织逐渐缩小,……   
[关键词]:栉孔扇贝;血细胞;颗粒细胞;透明细胞;内源酶;免疫特性;单克隆抗体;造血组织;交叉
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:中国海洋大学2002年