手机知网 App
24小时专家级知识服务
打 开
手机知网|搜索

猪圆环病毒2型ORF2基因表达及重组蛋白ELISA方法的建立

王忠田

  猪圆环病毒2型(Porcine circovurus type 2,PCV2)是引起猪断奶后多系统衰竭综合征等相关疾病的重要病原。PCV2的ORF2基因不仅是其主要结构蛋白的编码基因,而且也是区分PCV1和PCV2的重要区域,其编码蛋白具有良好的抗原性。本研究利用PCR技术扩增出PCV2BF株ORF2基因,并进行了分子克隆,成功实现了ORF2基因在大肠杆菌中的表达,对表达的重组蛋白进行了初步纯化,利用纯化的重组蛋白初步建立了检测PCV2抗体的ELISA方法。采用PCR技术对12个规模化猪场猪断奶后多系统衰竭综合征发病猪群进行了PCV2检测,完成6株PCV2分离毒株的全基因组序列测定与分析。1.参照GenBank发表的PCV2BF株基因序列,设计合成一对引物,对PCV2BF株ORF2基因进行PCR扩增,产物经琼脂糖凝胶电泳分析,呈现一条约720 bp的特异条带,将其回收后克隆到pGEM T-Easy载体。根据基因分析,设计一对带有酶切位点的引物,从克隆的pGEM T-ORF2重组质粒扩增出大小为593 bp的ORF2基因片段,然后克隆到表达载体pET-32a中,经XhoI和BamHI酶切鉴定,得到阳性重组表达质粒pET-ORF2。2.将重组质粒pET-ORF2转化到表达宿主菌BL21(DE3)中,经终浓度为2mmol/L的IPTG诱导,高效表达了ORF2基因编码的结构蛋白,重组蛋白表达量占菌体蛋白量的20%。经Western-Blot检测表明,表达的重组蛋白能够被PCV2阳性血清所识别,具有良好的抗原性。3.利用表达的重组融合蛋白作为抗原,建立了检测PCV2抗体的间接ELISA方法,并对ELISA的反应条件进行了摸索,确定了抗原的最适包被浓度为5μg/ml,最适包被条件为37℃1 h加4℃过夜,检测血清稀释度为1∶40,HRP-兔抗猪IgG的最适工作浓度为1∶400。包被的重组蛋白不与猪瘟、猪伪狂犬病、猪日本乙型脑炎、猪繁殖与呼吸综合征病毒的阳性血清发生交叉反应,表明建立的ELISA诊断方法具有良好的特异性。间接ELISA方法的建立为我国进行PCV2的诊断与监测以及血清学调查提供了一种技术手段。4.采用PCR技术对我国北京、天津、山东、广东、深圳、山西等地12个规模化猪场PCV2感染发病猪群进行了PCV2检测,结果表明,从发病猪和死亡猪组织中PCV2的阳性检出率为96%,说明PCV2感染在我国规模化猪场已相当严重。从发病猪组织中分离出6株PCV2,进行了全基因组序列测定,结果表明,深圳分离株(SZ株)的基因组全长为1768 bp,其余分离株的基因组全长均为1767 bp。与国、内外分离毒株的全基因组序列比较发现,我国PCV2分离株同欧、美分离株同源性很高。……   
[关键词]:猪圆环病毒2型;ORF2;表达;ELISA
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:中国农业大学2003年