手机知网 App
24小时专家级知识服务
打 开
手机知网|搜索

猪繁殖与呼吸综合征病毒全基因组分子遗传特征分析

高志强

  本研究用猪肺泡巨噬细胞(PAMs)从河北地区猪繁殖与呼吸综合征病毒感染猪场和发病猪场猪血清样本中分离到2株猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome vires,PRRSV),分别命名为HB-1(sh)/2002、HB-2(sh)/2002。采用RT-PCR、IFA和免疫电镜方法对这2个分离毒株进行了鉴定,并在PAMs上增殖和测定了TCID_(50)。采用5’Full RACE技术及RT-PCR技术,分段设计引物分别扩增并克隆了2个分离毒株的所有cDNA片段,测序后经序列拼接获得HB-1(sh)/2002、HB-2(sh)/2002的全基因组序列。序列分析表明这2个分离毒株均为美洲型PRRSV,进一步利用GenBank中其它国内外分离毒株的已知序列,用各种分子生物学软件对分离毒株的基因组分子遗传特征进行了生物信息学分析。1.将RT-PCR检测为PRRSV阳性的猪血清,接种从50日龄SPF仔猪制备的肺泡巨噬细胞(PAMs),分离到2株PRRSV,分别命名为HB-1(sh)/2002、HB-2(sh)/2002。接种物在接种PAMs 48h后开始出现明显的细胞病变,并通过RT-PCR确定了病毒在PAMs细胞上的增殖。利用间接免疫荧光抗体技术在接毒细胞的细胞浆中观察到了特异性的免疫荧光。2株病毒的第二代毒的TCID_(50)分别为10~(-7.5)/0.1ml和10~(-6.5)/0.1ml。通过差速离心法将病毒浓缩后,用1∶10稀释的PRRSV阳性血清与等体积超离样品作用后进行负染,电镜观察到了大小约60nm的病毒粒子。2.利用分离毒株的第二代细胞毒,采用5’Full RACE技术及RT-PCR方法,分段设计引物,成功扩增出PRRSV HB-1(sh)/2002和HB-2(sh)/2002的全部基因组cDNA片段,分别将其克隆到pGEM-Teasy质粒载体,对鉴定为阳性的重组质粒进行测序,经序列拼接获得2个分离毒株的全基因组序列。结果表明,HB-1(sh)/2002和HB-2(sh)/2002的全基因组长度分别为15411nt和15373nt(不包括PolyA尾)。序列比较显示二者的基因组结构相同,但发现HB-2(sh)/2002的Nsp2存在编码12个氨基酸的36个核苷酸缺失,结构蛋白GP3存在编码1个氨基酸的3个核苷酸缺失。二者的全基因组序列相似性为93.0%。3.序列比较结果显示HB-1(sh)/2002与国内外各美洲型分离株全序列相似性在89.1%~96.0%之间,但与欧洲型分离株LV株的差异较大,相似性为54.7%;HB-2(sh)/2002与国内外各美洲型分离株全序列相似性在88.7%~95.1%之间,与LV株的全序列相似性为54.3%,表明HB-1(sh)/2002和HB-2(sh)/2002均为美洲型分离株。依据Nsp2与ORF5序列对国内外分离株进行了系统进化分析,表明依据Nsp2序列美洲型分离株可初步划分为两个亚群;依据ORF5序列可划分为5个亚群,我国大陆分离株分属于其中的2个亚群,即HB-1(sh)/2002、HB-2(sh)/2002及CH-1a的遗传距离较近,属于1个亚群;BJ-4、S1和J1属于另1个亚群。对PRRSV的二级结构和表位分析结果显示,不同分离株间存在差异。……   
[关键词]:猪繁殖与呼吸综合征病毒;基因组;分子遗传特征
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:中国农业大学2003年