手机知网 App
24小时专家级知识服务
打 开
手机知网|搜索

天然食品防腐剂人溶菌酶编码基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

王颖

  人溶菌酶是存在于人体正常体液和组织中的一种非特异性免疫因子。它对人体完全无毒副作用,同时具有抗菌、消炎、抗病毒、抗肿瘤等作用,可被开发成口含片、胶囊、口香糖及口腔喷雾剂等产品形式。由于人溶菌酶来源有限,因此本研究提出通过遗传工程方法,利用毕赤酵母细胞生产人溶菌酶,一方面解决了人溶菌酶资源稀缺的问题,另一方面则能创造更大的经济效益。由于人胎盘组织中富含hLZM基因的mRNA,因此从人胎盘组织中提取细胞总RNA作为模板,根据GENEBANK中已发表的hLZM基因的cDNA序列,设计合成特异引物,经逆转录合成hLZM基因的cDNA序列,并以此cDNA序列为模板,经PCR扩增hLZM编码基因。经DNA序列分析证明与已发表的hLZM cDNA序列完全一致。通过EcoRⅠ和NotⅠ双酶切作用,将hLZM的编码基因按照质粒阅读框的转译方向插入到表达质粒pPIC9K的MCS中,构建重组表达质粒pPIC9K/hLZM。利用电转化方法转化表型为His~-的宿主菌KM71,利用MD培养基筛选到近1 200个His~+转化子。再经G418抗性的二次筛选,获得15株含高拷贝人溶菌酶基因的重组毕赤酵母转化子。当以甲醇进行诱导表达时,成功获得了1株高效分泌表达的重组菌株Pp135,其表达量为317mg/L,酶活性为32035u/mL。菌株Pp135经甲醇诱导,可将人溶菌酶分泌到培养基中,因此可在发酵上清液中直接检测到人溶菌酶的活性。该检测采用以溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)为试验菌的琼脂平板扩散法。研究发现培养基BGMM、BMM、MMC等均能诱导菌株Pp135表达人溶菌酶,由于培养基BGMM和MMC中存在干扰溶菌酶纯化的杂蛋白,并使溶菌酶产品带有异味和色素,因而确定利用BMM培养基进行重组菌株Pp135的诱导表达。实验最终获得381mg/L的表达量,若继续优化发酵条件,还有可能进一步提高菌株Pp135的表达水平。本研究为人溶菌酶的工业化规模生产奠定理论基础,这对带动人溶菌酶的规模化生产具有特殊意义,其推广应用将给社会带来相当的经济效益。……   
[关键词]:人溶菌酶(hLZM);巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris);分泌表达质粒pPIC9K
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:中国农业大学2003年