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森林脑炎病毒的鉴定以及生物学性状和核苷酸全序列测定的研究

马新英

  本试验对2001年自牡丹江分离的森林脑炎病毒(TBEV)MDJ-01株进行了鉴定以及生物学性状和核苷酸全序列的测定的研究。整个试验以1953年分离的TBEV森张株为对照。TBEVMDJ-01株和森张株经乳鼠脑内接种传代后,乳鼠均发病死亡,但死亡时间不同。两株病毒对BHK-21细胞都敏感,MDJ-01株的病毒滴度较森张株低。理化试验结果表明两株病毒为有包膜、不耐酸的RNA病毒。取接种MDJ-01株的鼠脑制作电镜标本,进行形态学观察,可见有包膜的直径约40nm的球形病毒。应用间接免疫荧光试验进行血清学鉴定,结果表明MDJ-01株为TBEV。通过RT-PCR技术扩增部分E蛋白序列并测序,在Genbank上进行同源性比较,发现MDJ-01株和森张株与TBEV Oshima5-10株的同源性最高,分别为94%、95%,从分子生物学水平上进一步证明MDJ-01株病毒为TBEV。在鉴定的基础上,本实验对两株病毒进行了核苷酸全序列测定。根据Genbank中已公布的TBEV Sofjin-HO株和Oshima5-10株核苷酸序列利用DNAStar软件设计10对引物,利用RT-PCR技术分段扩增病毒cDNA,克隆法测序。病毒基因组5′末端和3′末端序列采用RACE法扩增。测序结果用DNAStar软件拼接,在Genbank中检索6株TBEV编码区核苷酸序列、12株TBEVE蛋白核苷酸序列,并在DNAStar上进行核苷酸序列、由此推导的氨基酸序列比较及构建系统发生树。结果测得MDJ-01株5′端10997nt、森张株5′端10675nt,3′端约200nt均未测出。MDJ-01株和森张株5′-UTR分别长131nt和129nt,同源性为99.7%。MDJ-01株同森张株相比存在4处变异,即G_(19)→A、C_(71)→T、T_(75)→C及50nt后插入两个核苷酸。MDJ-01株和森张株编码区核苷酸序列全长10245nt,共编码3414aa。MDJ-01株与森张株编码区核苷酸、氨基酸同源性分别为98.0%、99.3%,由此认为MDJ-01株由森张株变异而来。MDJ-01株24个氨基酸发生变异,可能引起免疫原性和病毒毒力的改变。通过氨基酸比较还发现12个亚型特异氨基酸,可能是引起TBEV三个基因亚型特性不同的原因。从绘制的系统发生树中发现MDJ-01株和森张株均属于TBEV远东亚型,可能与Oshima5-10株、Sofjin-HO株共同起源于Sofjin株,由此推断TBEV可能经金翅雀、啄木鸟等鸟类在中国东北、前苏联、日本间传播。本试验对MDJ-01株和森张株进行了生物学性状和基因组全序列的比较,这将有助于阐明近年来TBE在我国东北再次发生流行的原因,同时为TBEV全长cDNA克隆、基因组结构与功能、诊断、防治等研究打下基础。486位氨基酸外的11个亚型特异氨基酸未见文献报道过,对于鉴定TBEV新分离株的基因亚型具有重要意义。……   
[关键词]:森林脑炎病毒;生物学性状;RT-PCR;核苷酸全序列测定;5’-UTR;多聚蛋白;系统发生树
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:河北农业大学2003年