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茶叶中β-葡萄糖苷酶基因cDNA克隆与序列分析

杨顺利

  茶树是我国重要的经济作物,香气是衡量茶叶品质好坏的关键指标之一。β-葡萄糖苷酶在茶叶香气和抗逆性方面有着举足轻重的作用。因此,尝试从茶叶中获取β-葡萄糖苷酶基因的cDNA序列,将有助于进一步搞清β-葡萄糖苷酶在茶叶花果香气形成中的地位和作用,充实茶叶香气形成的理论,也为以后利用基因工程手段改良茶树品种,提高茶叶品质、抗病虫能力以及该酶的转化、调控的研究奠定基础。本论文首次从茶叶中克隆出β-葡萄糖苷酶基因cDNA序列,结果如下:依据茶树叶片生化特点,应用Chomcznski一步法,并作了部分修改,从鲜叶中分离、提取总RNA。利用GenBank中已经登录的其它植物中该酶基因的保守序列,设计一对简并引物,采用RT-PCR技术,从茶树扩增出208bp的cDNA片段。将扩增片段克隆到PMD18-T上进行序列测定和分析,结果表明,此片段核苷酸序列与其他植物β-葡萄糖苷酶基因cDNA相应序列有很好的同源性,推断该PCR特异产物为茶树β-葡萄糖苷酶基因cDNA片段。以此特异片段设计特异引物,采用RACE技术分别获得β-葡萄糖苷酶cDNA3’端581bp和5’端895bp片段,后再依据上述两段序列设计一对引物,扩增出酶的全长序列1475bp。经Blast搜索表明:克隆所得碱基序列和推导的氨基酸序列与已克隆出的小松树、西葫芦拟南芥等植物体内β-葡萄糖苷酶基因的cDNA相应序列有40%—60%的同源性,因此我们推断扩增所得到的序列为茶树中β-葡萄糖苷酶基因的cDNA。利用分子生物学软件对氨基酸序列和二级结构进行分析和比较。结果表明,该序列的3’-端和5’端的非编码序列长度分别为189bp和233bp,开放阅读框为1050bp,编码350氨基酸,其转运肽长度为82个氨基酸,成熟蛋白由257个氨基酸组成。经Garnier法预测,茶树β-葡萄糖苷酶蛋白二级结构与其他植物相似,螺旋构象14.33%、伸展构象33.81%、折叠构象25.43%。前体蛋白的分子量为40kDa,等电点(PI)为5.2,为水溶性蛋白。……   
[关键词]:茶树;β-葡萄糖苷酶;聚合酶链式反应;生物信息学;互补DNA;cDNA末端快速扩增
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:安徽农业大学2003年