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鸡脂肪酸结合蛋白基因的克隆及其与肌内脂肪含量关系的研究

叶满红

  本研究通过构建北京油鸡基因组DNA噬菌体文库,筛选含鸡心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)基因的重组子,克隆出4株含鸡H-FABP基因片段的重组噬菌体。选用北京油鸡、矮脚鸡、泰和乌骨鸡、崇仁麻鸡、鹿苑鸡、霞烟鸡6个中国地方鸡品种以及一个引进品种爱拔益加肉鸡(AA鸡)共7个实验动物群体,将H-FABP基因和脂肪型脂肪酸结合蛋白(A-FABP)基因作为影响肌内脂肪含量的侯选基因,采用PCR-RFLP及PCR-SSCP分析方法研究H、A-FABP基因上的遗传变异,运用最小二乘法拟合线性模型,对所发现的多态位点与鸡生产性状的关系进行了分析,探讨了H、A-FABP基因作为影响鸡肉品质侯选基因的可能性。所得结果如下:1、在λ噬菌体EMBL3中构建了北京油鸡基因组DNA文库,滴度为3.84×10~5,基本上保证了文库的代表性。2、根据Genbank上一段从鸡脂肪文库中克隆的、与大鼠H-FABP基因有较高同源性的序列,通过比较不同物种间H-FABP基因核苷酸序列的相似性与同源性,在保守区设计特异性扩增引物P_1,首次扩增出鸡H-FABP基因第二内含子2Kb片段,并根据序列测定结果设计引物P_2,扩增其中221bp的片段,用于对基因组文库进行PCR法初选,确定含鸡H-FABP基因片段的阳性克隆所在的文库亚集。再以H-FABP基因第二内含子2Kb片段为模板,采用地高辛标记随机引物法合成标记探针,经Southern杂交对文库亚集进一步筛选,确定了4个含目的基因片段的阳性克隆,为进一步亚克隆测定鸡H-FABP基因的全序列提供了基础。3、应用PCR-RFLP分析在鸡H-FABP基因第二内含子上发现HhaⅠ-RFLP和MspⅠ-RFLP两个多态位点,其中HhaⅠ-RFLP位点上有三个等位基因A、B、C。测序分析表明:多态的产生是由于386位以及723位碱基T→C的替换造成的;MspⅠ-RFLP位点上有两个等位基因M、N,多态位点的产生是由于246位碱基T→C的替换造成的。根据鸡A-FABP基因第四外显子及第二内含子序列设计特异性引物P_3,用于扩增含鸡A-FABP基因第三内含子的1.5Kb片段,在第三内含子上发现一HinfⅠ-RFLP多态位点,该位点上有两个等位基因A、B。测序分析表明:HinfⅠ-RFLP的产生是由于700位碱基G→A的替换造成的。在北京油鸡和矮脚鸡两个群体共计505只个体中分析了三个PCR-RFLP位点的基因型分布情况,Hardy-Weinberg平衡适合性检验结果表明:北京油鸡群体在H-FABP基因HhaⅠ及A-FABP基因HinfⅠ-RFLP位点上处于平衡状态;矮脚鸡群体在A-FABP基因HinfⅠ-RFLP位点上处于平衡状态,在HhaⅠ位点上处于不平衡状态;在MspⅠ-RFLP位点上两群体均处于不平衡状态。另经x~2独立性检验表明在北京油鸡与矮脚鸡群体中HhaⅠ、MspⅠ、HinfⅠ-RFLP各位点的基因型分布存在极显著的差异(Prto.of)。4、根据鸡A-FABP基因第一外显子及第一内含子序列设计特异性扩增引物p4-P.,应用PCR-SSCP分析在A-FABP基因上发现P。、P。、Ps-SSCP H个多态位点,每个位点上都具有两个等位基因A、B。序列测定的结果表明:P。、p6《SCP单核着酸的变异是由碱基C—T的替换造成的,Ps-SSCP多态的产生是由G—A的替换造成的。对七个鸡群体共计728只个体三个PCR-SSCP位点的基因型分布情况进行了统计分析,Hardy叩einberg平衡适合性检验结果表明:除P厂SSCP在霞烟鸡群体中未处于Hardy-Weinberg平衡状态外,7个地方鸡品种民、Ps及P。-SSCP的基因频率和基因型频率都处于平衡状态(Ptoo.05厂另经 X’独立性检验表明在不同的鸡品种间 P。、Ps、PJSSCP的基因型分布存在极显著的差异(P<0.01)。5、应用SAS软件、用最小二乘法拟合一般线性模型(GLM)在北京油鸡及矮脚鸡群体中对所发现的6个多态位点各标记基因型间生产性状(特别是肌内脂肪含量)的差异进行显著性检验。统计结果表明不同的基因型之间生产性状有显著的差异。目前的分析初步确定鸡H、A-FABP基因可以作为影响鸡肌肉脂肪含量的侯选基因,有待于进行深入的研究。……   
[关键词]:;基因组文库;H、A- FABP;DNA多态性;肌肉脂肪含量
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:中国农业科学院2003年