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马齿苋多糖的分离纯化及抗氧化活性研究

韩果萍

  马齿苋为马齿苋科植物马齿苋的全草,具有清热解毒,散血消肿之功效。它作为药食两用的绿色野生植物,在抗菌、降血脂、抗衰老、增强免疫、降血糖等方面发挥着重要的药理活性作用;又因其含有丰富的营养成分,还可作为保健品开发利用。多糖具有丰富的药理活性,且无毒副作用,已广泛应用于临床及保健品市场。马齿苋在我国分布广泛,资源丰富,是一种具有很大开发潜力的植物。本文以马齿苋多糖为研究对象,目的在于探索其未被发现的多糖及其所具有的生物活性,为进一步开发利用奠定基础。有关马齿苋多糖的报道不多,仅涉及其含量的测定及对其粗多糖抗肿瘤作用的研究。对其进一步的分离、纯化、组成分析及其组分药理作用的研究未见报道。本文主要研究了马齿苋多糖的提取工艺、分离纯化及对所得组分进行了纯度鉴定、分子量测定,组成分析,并用H_2O_2/Fe~(2+)体系法和AP-TEMED体系法研究了马齿苋多糖半纯品及精制多糖清除超氧阴离子自由基和羟基自由基的抗氧化活性。采用传统的多糖提取方法,即热水回流提取,乙醇沉淀,沉淀经95%乙醇,无水乙醇、丙酮反复洗涤,50℃真空干燥得马齿苋多糖粗制品。在提取过程中,考察了不同提取温度、料液比、提取时间及提取次数对提取率的影响,并通过正交实验,比较了影响提取率的主要因素的主次关系,优化了提取条件,确定了最佳的提取工艺。对粗多糖中蛋白质的去除,综合考虑了Sevag法、TCA法和木瓜蛋白酶结合Sevag法三种不同方法各自的脱蛋白率及多糖的损失率。酶+Sevag法有其明显的优点,既可较为完全的脱除粗多糖中的蛋白成分,又能大大降低多糖的损失率。所以最终确定用酶法切断蛋白链,结合经典的化学法(Sevag法),对马齿苋粗多糖进行脱蛋白处理。脱蛋白后的多糖经透析得多糖半纯品(POL)。利用DEAE-纤维素离子交换层析柱和Sephadex G-200凝胶层析柱,先后对马齿苋多糖半纯品(POL)进行了进一步分离纯化。DEAE-纤维素柱分别用水、0.1MNaCl,0.5MNaOH洗脱分得三种级分,即水洗级分(POLⅠ)、盐洗级分(POLⅡ)和碱洗级分(POLⅢ)。这三种级分再经过Sephadex G-200进一步分离纯化,得三个主要级分POLⅠb、POLⅡa及POLⅢ′。本实验选定POLⅠb、POLⅡa及POLⅢ′为深入研究对象。三种精制多糖的纯度鉴定采用醋酸纤维素薄膜电泳和Sephadex G-200凝胶柱层析法。三种精制多糖的电泳均呈单一蓝色斑点,柱层析图均为单一对称的峰,纯度鉴定结果表明POLⅠb,POLⅡa及POLⅢ′都是均一的多糖。采用凝胶过滤法测定各组分的平均分子量分别为18kD,56kD,410kD。其中POLlll”的分子量最大,POLIb分子量最小。各精制多糖通过ZM硫酸水解,再用气相色谱法测定各多糖的组成及摩尔比。结果表明 POLIb和 POLlll”主要由葡萄糖和半乳糖组成,摩尔比分别为 2.39:l.00和0.65:1.00;POL 118主要由阿拉伯糖、木糖、果糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖组成,其摩尔比是0.62:0.74:1.06:0.55:0.71:0.15。紫外光谱显刁F在26onm、280urn处均未见核酸和蛋白质的吸收峰。红外光谱分析得知三种多糖均有多糖的特征吸收峰,其中 POLIb和POL 11a为含 a-糖昔键的化合物,POLlll”则为含 p-糖昔键的化合物。抗氧化活性实验主要是研究马齿觅多糖半纯品叩)及三种精制多糖叩、POL 11a和POLlll’)对 0。‘和·OH的清除作用。利用比仙/Fe’”体系产生。OH,AP-TEMBD体系产生 0。“,分别比较了POL,POLIb,POL 11a及 POLlll 对·OH和0。“的清除率。结果表明,POL具有抗’OH和0。‘的双重功效,且呈剂量依赖关系。POLIb清除刃H和0;“活性较弱,但其活性大小也与多糖的用量成正比,POLlla对·OH和0。”均无清除作用。POLlll’具有较高的清除·OH作用,但对 0。‘不起作用。POLlb,POLlla及 POLlll’为首次从马齿觅中分离得到,它们的抗氧化生物活性为其应用于实践提供了科学依据。……   
[关键词]:马齿苋;多糖;分离纯化;组成分析;抗氧化活性
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:陕西师范大学2003年