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大肠杆菌来源核酶RNase P催化亚单位对人巨细胞病毒DNA聚合酶mRNA片段体外切割的研究

陈浩军

  大肠杆菌来源RNase P是催化切割ptRNA 5′端成熟的天然核酶,该酶的催化核心为一个377nt的RNA亚单位(M1 RNA),能在具备高盐离子和适当Mg~(2+)的体外缓冲环境中对RNA底物进行位点特异的切割。RNase P是结构识别酶,M1 RNA底物至少包括两个要件:1 游离NCCA-3′末端;2 特异互补的双链RNA区域。能与mRNA形成RNase P识别的底物形式的小片段RNA称为外部引导序列EGS(external guide sequence)。将EGS共价连接到M1 RNA的3′末端成为附属于M1 RNA的一段引导序列,称为GS。附带GS的M1 RNA成为了具备自我引导和序列特异切割能力的核酶—M1GS。本课题以人巨细胞病毒(HCMV)DNA聚合酶基因为靶序列,设计构建人工核酶M1GS,研究对该基因mRNA片段的切割作用,为进一步研究以RNase P为基础的反义RNA技术抑制病毒基因表达奠定理论基础。从HCMV DNA聚合酶UL54基因序列中搜寻了11个适合GS互补的靶位,人工核酶M1GS转录模板DNA包含有T7启动子、M1 RNA基因、连接序列以及GS序列四个组成部分。将UL54基因中M1GS靶位集中分布的4个不同片段分别克隆至pGEM3z质粒,形成PU54-A、PU54-B、PU54-C、PU54-D四个底物片段的模板质粒。对M1GS DNA模板和4个底物模板分别进行体外转录,获得核酶M1GS的RNA片段以及带有~(32)p放射性标记的四个底物RNA片段。将M1GS与对应的底物片段在含有100mmol/NH_4~+和100mmol/Mg~(2+)的体外切割缓冲液中混合反应,从自显影结果中筛选到7个具备特异切割活性的M1GS核酶。采用不同的M1GS核酶:底物浓度比例进行体外切割反应,确定了最佳核酶:底物浓度比例为2:1;破坏底物高级结构的切割实验表明,底物高级结构影响了M1GS核酶的体外切割效果。我们的研究成功地利用引导序列,将核酶RNase P催化亚单位M1 RNA构建为序列识别的核酶M1GS,证实了核酶在抗病毒方面的应用价值。……   
[关键词]:核酶RNase P;引导序列GSs;人巨细胞病毒HCMV DNA聚合酶
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:暨南大学2003年