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重型乙型肝炎免疫细胞差异表达基因研究

刘映霞

  目的NK细胞的细胞毒作用在乙型肝炎病毒(HBV)诱导的肝损伤中起了重要作用,而某些宿主细胞因子和受体基因在这些免疫细胞上的异常表达,可能增强NK等效应细胞对病毒感染细胞的细胞毒作用而参与重型乙肝(FHB)的发病机制。宿主基因表达在免疫应答和炎症反应的发生发展和转归方面所起的重要作用也越来越引起重视,但宿主免疫细胞基因表达在重型肝炎发生中的作用仍不清楚。本实验旨在筛选重型乙肝PBMC差异表达基因,研究其在NK等免疫细胞中的表达及与肝病严重性的关系,从免疫细胞受体基因表达及调节角度探讨乙型肝炎重型化致病机理,为FHB防治开辟新思路和新的前景。方法首先应用表达谱基因芯片与抽提自10例FHB和10例无症状表面抗原携带者(ASC)的PBMC中标记的cDNA杂交以检测基因表达,应用GenePix 4000B扫描芯片,ImaGene3.0软件分析数据并筛选差异表达基因。然后应用RT-PCR及免疫组化S-P法,检测所筛基因在FHB、慢性肝炎(CHB)、ASC及正常对照人群的PBMC及肝脏中的差异表达。同时应用流式细胞术(FCM)分选经诱导培养的NK细胞,检测所选基因在FHB、ASC和正常人群中的差异表达。以HepG2、K562、CNE细胞株作为靶细胞,应用MTT比色法分析所选基因对NK细胞细胞毒作用的影响及特异性抗体对细胞毒作用的阻断效应。最后,应用基因重组技术构建含所筛目的基因的真核表达质粒,经双酶切、PCR和DNA测序证实该重组真核表达质粒含有所需目的基因。然后利用脂质体介导将重组真核表达质粒转染CHO细胞,经含G418选择性培养基筛选获得稳定转染重组真核表达质粒的CHO细胞,经RT-PCR和Western Bloting证实转染的CHO细胞中有目的基因表达,然后应用MTT比色法分析含目的基因的重组真核表达质粒对NK细胞的细胞毒性作用的影响。结果1、表达谱芯片筛选结果:应用基因芯片技术建立了重型乙肝PBMC基因表达数据库。在 8192个基因中,筛选出则B和 ASC差异表达 2倍以上的基因 249(占 3们,上调基因 SI个,下调 168个,其中细胞信号和传递,细胞周期和代谢,凋亡及炎症相关类基因占79儿2、NKGZD InRNA表达:FHB、CHB、对照组及 ASC的 PBMC中 NKGZDmRNA表达呈依次递减趋势。FHB组 NKGZD mRNA表达最强,与其它各组卜较,差异有显著性(P<0.of)。3、免疫组化结果:在肝脏汇管区表达NKGZD的阳性细胞百分率不同,差异有显著性um.01人FHB组表达NKGZD的阳性细胞百分率最高,分别与其它3组比较,差异有显著性uo.01人CHB①3,G4)组与正常对照组比较,差异有显著性u刃.of人但mB①,GZ)组和正常对照组比较,差异无显著性u川.05)4、FCM和 FACS分析结果:应用荧光激活细胞分类仪和流式细胞术分析,分选后能与抗CD16化D56 InAb结合的NK细胞纯度高达99%以上。FHB组NK细胞NKGZD蛋白表达最强,分别与ASC及对照组比较,差异有显著性(P<0.of)。ASC组 NK细胞 NKGZD表达最弱,分别与其它2组比较,差异有显著性u的.of人5、MTT卜色法结果:NK细胞对 3种肿瘤细胞K562、HePGZ和 CNE均有较强的细胞毒效应。NK细胞的杀伤活性分别为68兄65.7%和55.l%。力入抗 NKGZD PAb(0.sing/L)后,可显著抑本 NK细胞对 K562、HePGZ细胞的细胞毒效应。NK细胞对两种靶细胞的杀伤活性分别下降了 82.9%和 75.6%倍。但抗 NKGZD PAb不能显著抑策 NK细胞对 CNE细胞的细胞毒效应。厂二6、人NKGZD基因在m 细胞中的表达及鉴定:获得的NKGZD的cDNA序列与GeneBank登陆的cDNA序列一致。成功地构建了稳定表达的重组真核表达质粒PCDNA3.lw。转染* 细胞后,获得可稳定表达NKGZD的基因工程细胞株。NK细胞与转染了NKGZD的CHO细胞共培养后,对K562细胞的杀伤率为88见大于与转染空白质粒的CHO细胞共培养后的杀伤率伤9卿。其杀伤效应能被NKGZD多克隆抗体所阻断。结论1、经表达谱基因芯片证实,HBV感染机体导致重型肝炎过程中,明显地改变了宿主细胞内基因表达,FHB和 ASC差异表达基因占 3%(249/8 192)。2、乙型肝炎外周血PBMC、NK细胞表面NKGZD过度表达与MB的发生相关。3、肝组织内免疫细胞NKGZD过度表达与FHB的发生有关。4、NKGZD介导的细胞毒作用在激活NK细胞对K562、HepGZ细胞的杀伤中起主导作用。5、抗 NKGZD PAb可通过封闭训 细胞表面的 NKGZD分子而抑制其对肿瘤细胞吃HepGZ、K562)的细胞毒效应。6、成功地构建了重组表达载体pCDNA3.1十,并实现了在CHO细胞中的稳定表达。……   
[关键词]:乙型肝炎病毒;重型肝炎;NK细胞;外周血单个核细胞;细胞毒效应;NKG2D;基因表达
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:中南大学2003年