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利用聚合酶链反应(PCR)鉴定小鼠早期胚胎性别的研究

高嵩

  哺乳动物早期胚胎性别鉴定是生物领域的一项重大课题,同时也是胚胎工程的一个重要环节。本实验采用PCR方法,通过SRY/Sry基因的序列分析、特异性引物的设计以及PCR检测等环节完成了对小鼠早期胚胎的性别鉴定,并建立了一套完整的PCR扩增体系。本实验通过对几种哺乳动物SRY/Sry基因核心序列的分析,分别设计出特异于小鼠、人以及牛的三对PCR扩增引物,这三对引物对雄性小鼠白细胞Sry基因的扩增率分别为96.7%、86.7%和26.7%,前两者差异不显著(p>0.05);前两者与后者差异显著(p<0.05)。扩增效果最好的为特异于小鼠Sry基因的第一对引物,其序列为:上游(Sry1):5’GGCTACTTACGGAAGTACCAC 3’;下游(Sry2):5’GCCTATGAAGAGCGCCACGTC 3’。采用该对引物,分别以10mmol/L、15mmol/L、25mmol/L以及30mmol/L的Mg~(2+)浓度配成PCR反应缓冲液扩增雄性小鼠白细胞Sry,扩增率分别为30%、60%、100%和100%,前两者均显著低于后两者(p<0.05)。将PCR循环次数分别设为25、36和50,扩增结果基本一致,但以36次为宜。经测序,扩增产物长度为192bp,且与小鼠Sry基因核心序列相符率为98.4%,差异不显著(p>0.05)。采用确定后的最适宜PCR扩增体系扩增12枚小鼠孤雌胚,结果无一出现特异扩增带,鉴定准确率为100%。对随机抽取的小鼠8-细胞期、16-细胞期、桑椹期以及囊胚期胚胎进行PCR检测,阳性胚胎率分别为13.3%、36.7%、46.7%和43.3%,与50%的理论值相比较,除第一组外(p<0.05),差异均不显著(p>0.05)。本实验建立的PCR扩增体系对于16-细胞期以后(包括16-细胞期)小鼠胚胎的性别鉴定具有较高的可信度,但还不能完全对早于8-细胞期(包括8-细胞期)的胚胎进行PCR检测。因此,今后工作的重点应放在完善实验条件、提高PCR扩增体系对超微量DNA模板的扩增能力即检测灵敏度等方面。……   
[关键词]:性别鉴定;小鼠;早期胚胎;PCR
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:西南农业大学2003年