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中等纯度重组人表皮生长因子(rhEGF)的分离纯化及在美容产品中的应用

陈秋东

  基因重组人表皮生长因子(recombinant human Epidermal Growth Factor,rhEGF)在医学上有显著的创伤修复、愈合伤口等功效。近年来发现,rhEGF在美容产品领域也有广阔的应用前景,具有促进皮肤细胞更新、防止皮肤衰老等功能。采用分泌型表达的基因工程大肠杆菌培养获得rhEGF,根据美容等日化行业对rhEGF的质量与纯度要求,设计了一条成本低廉、简便快速、能满足日化产品活性添加纯度要求的rhEGF分离工艺,得到了中等纯度的rhEGF冻干粉产品,并试制出含rhEGF的美容化妆品,观察了使用效果。通过启发式方法设计了分离纯化rhEGF的工艺路线,包括基因工程大肠杆菌发酵液离心得到上清液、上清液盐析、透析脱盐、离子交换树脂层析、再脱盐、脱色和冻干等过程。通过正交和单因素试验考察了各因素的影响程度和最佳的水平。研究了中等纯度rhEGF冻干粉中rhEGF活性在不同温度、pH和稳定保护剂等条件下的变化,开发了在美容化妆品中添加rhEGF的关键工艺,并利用随机双盲法结合统计学分析研究了含rhEGF美容化妆品使用疗效的显著性。中等纯度rhEGF冻干粉生产工艺的最佳操作条件为:1)rhEGF发酵液在4℃,6000rpm离心25min获得上清液(0.16-0.21g rhEGF/L);2)上清液在冰浴中缓慢加入361g(NH_4)_2SO-4固体/L(60%饱和度)盐析,溶液pH控制在6.0,低速(60rpm)搅拌2h后静置4h,离心得到沉淀;3)沉淀用pH 7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)溶解得rhEGF溶液,装满2/3透析袋脱盐,对透析液(水)的比例为1:40,每次透析2h,更换5次透析液后得到rhEGF盐析透析液(1.30-1.60grhEGF/L);4)rhEGF盐析透析液经层高10cm(XK16/20)的凝胶型弱碱阴离子DEAE Sephadex-A50层析,流速控制在150mL/h,一次进杆体积75mL,用含0.5mol/L NaCl的PBS(pH7.4)洗脱得到rhEGF离交液(4.42-5.44g rhEGF/L);5)经再次透析脱盐的rhEGF离交液流经层高7.5cm(XK16/20)的大孔型弱碱阴离子D314树脂脱色,溶液pH5.0,流速控制60mL/h,一次进样体积120mL,收集的流出液即rhEGF脱色液(3.54-4.35g rhEGF/L);6)rhEGF脱色液冻干得到中等纯度的rhEGF冻干粉。通过以上分离提纯工艺,冻干粉产品rhEGF的纯度达到32%以上,整个工艺rhEGF得率53%以上。实验表明rhEGF冻干粉中加入10%甘露醇、10%丝蛋白或1%低分子透明质酸钠可以减少rhEGF活性损失的50%以上(25℃室温下储存30天),而且与rhEGF有正协同美容效果。1%透明质酸(HA)与1%丝蛋白同时存在能使rhEGF水剂的有效治疗的浓度从300μg/mL降低到100μg/mL。统计学分析显示,rhEGF冻干粉水剂(含终浓度1%HA和1%丝蛋白)对治疗皮肤的粉刺、皱纹和衰老等浙江大学硕士学位论文\自动少摘要效果较好,使用前后差别有显著和高度显著性叩4.05刀.ofL含 rhEGF美容化妆品中 rhEGF最佳添加量为终浓度 200pg rhEGF/mL,在生产结束前温度降至40℃左右时采用“微量稀释法”添加到中性的化妆品液体或营体中。含rhEGF美容化妆品使用30天后与使用不含rhEGF的化妆品对照组比较有显著差异,rhEGF美容化妆品总平均有效率为84.9%。以上研究结果表明中等纯度rhEGF冻干粉符合美容化妆品的添加要求,分离操作简便,产品成本低廉。试制的含甘露醇、HA与丝蛋白保护和增效的rhEGF美容化妆品达到了预期的去痘修复。去现、#L袁老与大田等效果,为fhEGF人规模用于R化产品打下了基础。……   
[关键词]:人表皮生长因子;分离;纯化;离子交换;化妆品;应用
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:浙江大学2003年