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溶菌酶和重组人干扰素-γ包涵体体外折叠复性的研究

高永贵

  迄今为止,人们对确信存在的第二遗传密码——蛋白质折叠密码还知之甚少。如何对包涵体蛋白进行高浓度、高收率的复性以获得活性产品是人们经常面临的一个难题,现已成为生物工程产业化的瓶颈之一。为此,本文对模型蛋白溶菌酶和基因工程药物人干扰素—γ包涵体蛋白的体外折叠复性进行了研究,以期促进这一问题的早日解决。首先以溶菌酶为模型蛋白,通过研究还原剂二硫苏糖醇(DTT)对其变复性过程中自由巯基和复性的影响,结果发现若蛋白质浓度不超过40 mg/mL,变性液中DTT最适浓度为30mM,这样直接稀释复性时无需脱除DTT,简化了后续的复性过程。溶菌酶的变性程度对复性效果有重要影响,因此研究了溶菌酶合适的变性条件,达到了提高复性收率的目的。稀释复性法是研究其他方法的基础。通过对高浓度溶菌酶的直接稀释复性法的研究,发现最适GSH浓度为3~6mM,GSH:GSSG则为2~5,此外还需添加3~4M脲。同时在此范围内,合适脲浓度随蛋白质浓度增加略有增大。与一步稀释复性法相比,分步流加变性溶菌酶的复性操作不仅能够获得较高的复性终浓度,而且复性收率提高10%~15%,且降低了脲浓度。然后着重探讨了体积排阻层析复性溶菌酶的条件,包括柱高、GSSG与GSG的量及比例、脲浓度、流速、上样量(上样方式和上样体积)以及蛋白质浓度。首次探讨了体积排阻层析复性方法的连续上样操作,并与单次上样操作进行比较,结果两者的活性收率没有差异,但连续操作提高功效约25%,而且节约了复性缓冲液。在提出变性蛋白质体外复性过程的动力学模型和模型方程求解的基础上,采用C~(++)程序对模型方程与溶菌酶稀释复性的实验数据进行了拟合,拟合系数R基本上在0.98~0.99之间,表明动力学模型能够很好地描述溶菌酶的体外复性过程。复性液中添加脲后使得速率常数K_2和K_3值减小,复性时间延长,但却增加了K_2/K_3,说明脲对聚集反应具有更强的作用,这正是适量脲促进溶菌酶复性的机理。根据拟合出的脲浓度与速率常数K_2和K_3的数学表达式,并结合模型方程,首次探讨了如何从理论上对折叠复性的收率进行预测以及对复性条件进行优化,特别是根据蛋白质浓度而选取最适脲浓度,从而可为复性方法和工业复性过程的设计提供重要的理论指导。采用单因素和正交试验相结合的方法,对重组人IFN-γ包涵体的洗涤纯化进行了研究,最终使IFN-γ包涵体纯度达到80%以上,目标蛋白仅损失约15%。浙江大学博士学位论文摘要然后考察了体积排阻层析技术复性IFN-Y包涵体,结果表明该技术不仅具有促进变性 IFN-Y包涵体的体外再折叠,而且对目标蛋白具有纯化作用。在实验室建立IFN-Y活性测定的基础上,对体积排阻层析复性IFN-Y包涵体的方法进行了研究,并获得了比活为6.09 gi 06IU/mg,浓度为0.24 mg/mL的IFN-v样品,方法的收率为82.1%。最后提出从基因工程菌pBV220IFN1DH5a生产活性IFN1的工艺。在实验室制备新型小分于伴侣Mini-GroEL的基础上,研究了游离小分子伴侣协助正N-Y包涵体的再折叠。根据小分子伴侣具有 Histidine tag的特点,首次设计了Ni-NTA亲和固定化小分于伴侣柱复性正N-Y包涵体的实验装置。研究结果表明,该装置不仅可以避免变性剂对小分子伴侣及固定化结合损害,而且连续重复使用4次,再折叠IFN-Y的活性大小没有明显变化。使用该装置复性丁N-Y包涵体,一次进样0.98mg变性IFN-Y包涵体,经过固定化小分子伴侣柱后可得到活性达 6.4X 10勺U/mg、浓度为 0.14mg/mL的 IFN-Y样品,操作非常方便。……