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动物源性金黄色葡萄球菌耐药性分析与氟喹诺酮类耐药菌株的基因突变研究

李乾学

  采用K-B法,以ATCC25923标准质控菌做对照,从吉林省6个地区分离的201株金黄色葡萄球菌对20种抗菌素的药敏试验结果表明,201株均表现出不同程度的耐药性,对青霉素、氨苄西林、诺氟沙星、庆大霉素、氯霉素、链霉素的耐药率最高,分别为61.1%,55.7%,82.6%,93.5%,55.7%,93.5%。对红霉素、四环素、环丙沙星、依诺沙星、罗美沙星、复方新诺明、卡那霉素呈中度耐药,耐药率为22.3%~36.8%。对氧氟沙星、痢特灵、阿米卡星、克林霉素、利福平较敏感,耐药率为0.5%~7.5%。而对头孢唑啉、头孢噻肟高敏感。吉林省金黄色葡萄球菌的耐药性以多重耐药为主。对临床分离和人工诱导耐氟喹诺酮类药物金黄色葡萄球菌的gyrA和grlA基因突变情况进行了研究。实验选用了5株不同动物源性的且对氟喹诺酮类药物呈高、低度耐药的金黄色葡萄球菌菌株和1株敏感标准金黄色葡萄球菌标准菌株28001,3株经标准敏感菌株28001人工诱导对氟喹诺酮类药物呈低、中及高程度耐药的突变株。分别提取各菌株的染色体DNA,并对gyrA和grlA两基因进行了聚合酶链式反应(PCR)和克隆、测序,最后应用计算机辅助软件WDNASIS对测序结果进行分析,以期阐明金黄色葡萄球菌gyrA和grlA两基因的突变与其对氟喹诺酮类药物产生耐药性的关系。对从牛、鸡和猪等动物源性金黄色葡萄球菌采用试管二倍稀释法进行了最小抑菌浓度(MIC)测定。各菌株对盐酸环丙沙星、诺氟沙星、恩诺沙星和氧氟沙星的MIC范围为4~128ug/ml,证明皆为耐氟喹诺酮类药物的金黄色葡萄球菌。用亚MIC连续递增式传代培养法获得了对恩诺沙星稳定的呈低度、中度及高度耐药的金黄色葡萄球菌28001c、28001e、28001g,对恩诺沙星的MIC分别提高至4、16、128ug/ml,对盐酸环丙沙星、诺氟沙星和氧氟沙星的MIC范围分别为4~≥128ug/ml、64~≥128ug/ml、2~128ug/ml。以上结果表明,无论临床分离的金黄色葡萄球菌,还是人工诱导的耐氟喹诺酮类药物的突变株,都在恩诺沙星、盐酸环丙沙星、诺氟沙星和氧氟沙星四种药物之间存在交叉耐药性。按常规的方法提取了各菌株的染色体DNA,根据金黄色葡萄球菌gyra和yrta基因耐氟喷诺酮类药物决定区(oma)外侧核着酸序列分别设计并合成了101-l、101-2和101-3、1014两对引物,进行了PCR扩增,所扩增的片段长度均为6I sbp,琼脂糖凝胶电泳鉴定均获得特异条带,分另回收各特异条带,并与 pMD181载体连接,转化至 ll09大肠杆菌感受态细胞中,a互补成功地筛选到阳性克隆。提取重组质粒进行双酶切鉴定,测序。将所测定序列与已发表的金黄色葡萄球菌群rA和grta序列进行核耷酸和氨基酸序列同源性分析,结果表明,各序列的核着酸序列同源性均在叨%以上。敏感菌28001的d基因序列同源性为99.4%,存在4个位点的非氨基酸替换突变,且为生物界常见的C—T突变,其氨基酸序列同源性为100%。其grfa基因序列和氨基酸序列同源性皆为100%。所有耐氟隆诺酮类药物的金黄色葡萄球菌在grta上是第80位氨基酸发生了替换突变,在gyrA上是第84或88位氨基酸发生了突变。其中2株临床分离和2株人工诱导低程度耐药的金黄色葡萄球菌只在grfa基因上出现点突变,为Se毗C)一Phe(TG域伽(T C),在gyrA基因上未发生任何突变;其余3株临床分离和二株人工诱导高程度耐药的金黄色葡萄球菌不仅在grta基因上出现Ser80(TC)一Phe(TGC)或协u C)突变,而且在srrA基因上出现Ser84cyCA)一euM)或Ala(GCAXGin88(GAA)一hs(ih)的突变。这些结果表明,grlA基因Ser80和gyrA基因Ser84、Gin88基因突变可能参与构成金黄色葡萄球菌耐氟应诺团类药物的分子机制,且Ser的突变是最重要、最有意义的突变。低程度耐药要求在grlA上存在单位点的基因突变,即在拓扑异构酶IV上存在单位点氨基酸替换突变,而高程度的耐药需要DNA旋转酶和拓扑异构酶IV的氨基酸同时发生突变。无论临床分离还是人工诱导的耐氟呼诺酮类药物金黄色葡萄球菌,均在grta上存在Ser问C)-Phe(TG)或伽uC),这一结果表明,对恩诺沙星、盐酸环丙沙星、诺氟沙星和氧氟沙星来说,其作用于金黄色葡萄球菌的首要靶位酶是拓扑异构酶IV。而DNA旋转酶是次要靶位酶。……   
[关键词]:金黄色葡萄球菌;耐药性;氟喹诺酮类药物;基因突变
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:中国人民解放军军需大学2002年