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β-肾上腺素受体激动剂克伦特罗的免疫特性及中毒病理学研究

王选年

  β-肾上腺素受体激动剂盐酸克伦特罗(Clenbuterol,CL)具有促进动物生长、增加肌肉含量、降低胴体脂肪蓄积、提高瘦肉率的作用,俗称“瘦肉精”。但是,CL在动物体内存在广泛的积累性残留,对食用者的安全造成潜在的危害,急性中毒事件屡有发生。到目前为止,没有任何国家允许CL作为生长促进剂用于食品动物的生产之中,欧盟、美国FDA及我国政府都制定了严格的残留标准。在我国盐酸克伦特罗的违禁使用和急性中毒事件一直是公众关注的焦点问题。建立有效的残留监督检测体系、提高人们对CL中毒危害的认识是治理其非法使用的有效措施。本文在研究药物半抗原免疫特性的基础上以CL结合抗原免疫Balb/c小鼠,应用杂交瘤技术制备抗CL单克隆抗体,以单克隆抗体膜层析技术设计CL快速检测EIA试剂盒和快速检测试纸条,并应用GC-MS和HPLC等确证分析法确证EIA分析方法的灵敏性、特异性和稳定性。同时,进行了CL在猪尿液中的消除规律和实验动物中毒的病理学研究。用重氮化法将半抗原CL偶联于载体蛋白BSA和OVA,形成偶联抗原BSA-CL和OVA-CL。以BSA-CL免疫8周龄Balb/c小鼠,以OVA-CL检测免疫鼠血清抗CL效价(<10~(-4))。使免疫鼠脾细胞与NSO浆细胞瘤细胞融合产生分泌CL单抗的杂交瘤细胞。筛选出C-4G1、C-2H6、C-2D6和C-4C9共4株高敏感性和高特异性杂交瘤生产单抗,其单抗的间接ELISA效价分别为5×10~(-5)、3×10~(-4)、6×10~(-4)、2×10~(-5);同种型分别为IgG_1/κ、IgG_1/κ、IgG_(2a)/κ、IgG_(2a)/λ。C-4G1的亲和力常数K=1.68×10~8 L/mol,C-2H6的亲和力常数K=1.3×10~8 L/mol。经WestGold蛋白质印迹鉴定单抗与CL特异性结合。应用C-4G1和C-2H6单克隆抗体以间接ELISA模式设计竞争性CL快速检测试剂盒(CL-Kit)。CL-Kit标准曲线呈典型的S型,符合4参数Logit曲线拟合。CL单抗对CL的IC50为7.94llgllnL,沙丁胺醇旧b)的IC50为1000ng/InL,肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素和来克多巴胺的IC刘均36400ng/InL;与Sb的交叉反应性为0.79%,与异丙肾上腺素的交叉反应性为0.12%,而与肾上腺素、去甲肾上腺素、来克多巴胺、各类抗生素及多种维生素均无交叉反应性。该试剂盒线性检测范围为0.5八,相关系数R乙0.996。各标准品的吸光值变异系数为2.3%刁.6%。试剂盒测定回收率在91见时 见,批内变异系数均小于20呢,批间变异系数均小于10%。试剂盒在保存期内稳定。胶体金点免疫结合法(Dot Inunnobinding Assay)检测CL抗原的最小检测浓度为 1.25 pg/mL,最小检测量可达 2.5 pg。试纸条测定 CL抗原含量的敏感度可达 1.9 ngllnL。建立了猪尿液中CL残留检测的GC-MS测定方法和饲料中CL含量测定的HPLC测定方法。并以此方法确证了CL-Xit的敏感性、特异性和稳定性。用CLXit测定饲喂CL饲料的猪尿液样品中CL含量,采用药物代谢动力学计算程序分析CL在猪尿液中的消除规律。表明CL在机体中积累性残留较大,连续饲喂 Zld,停药 12h后尿液中 CL残留量达 181.15ng/InL。停药22d后尿液中含量降至*以下。CL在尿液中呈双相性消除,消除半衰期飞。=18h,TI。。=108h。CL结合抗原免疫家兔门g只,免疫l必次)可导致全身瘫痪症状门历人中毒小鼠(腹腔注射CLsing/kg,。l咖,连用50d)发生实质性坏死性心肌炎变化。显微镜检查,心肌细胞颗粒变性、断裂、溶解,肌纤维横纹消失。大部分。O肌表现为团块状无结构均质样的凝固性坏死。坏死部位深染伊红。在肌纤维间发生淋巴细胞浸润。……   
[关键词]:β-肾上腺素受体激动剂;盐酸克伦特罗;半抗原;免疫;残留检测;药物代谢;心肌坏死;食品安全
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:中国人民解放军军需大学2002年