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乳酸菌优良菌株的选育及直投式酸奶发酵剂的研制

张兰威

  为了提高我国酸奶的品质和生产水平,缩小与发达国家在直投式酸奶发酵剂的差距,本课题对酸奶菌种(嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌)的大量菌珠进行选育,并从工业化生产的角度考虑系统研究了高活力乳酸菌发酵剂增菌、冷冻干燥,多菌种组合的机理和工艺条件。结果如下:1.乳酸菌菌株的分纯及选育由不同来源商业发酵剂BS和直投式发酵剂DVI在特定培养基上划线分纯,得到20珠球菌、12珠杆菌。菌株经活化后连续五代发酵脱脂乳,综合考虑酸度、pH值、感官、粘度和和凝固时间各项指标,选出六株杆菌分别为:350L、380L、TM-111L、V1L、95L及前期优选B3L,球菌五株分别为:TM-111S、900S、96S、YC380、SH9。经形态学和生理生化初步鉴定,可以初步判定所选择的球菌为嗜热链球菌,杆菌为保加利亚杆菌。将优选出的球菌和杆菌以1:1混合发酵脱脂乳,根据滴定酸度、pH值和粘度选出发酵性能最好的球菌和杆菌组合为:TM-111S与TM-111L、900S与95L、900S与TM-111L、900S与V1L、TM-111S与B3。2.优选的保加利亚杆菌菌株紫外诱变及驯化对保加利亚杆菌B3、TM-111L进行紫外菌种诱变选育,选取致死率为80~90%的紫外照射条件为:选择在20w紫外灯,菌悬液距紫外光源30cm,照射2min。经过复筛选出4株对低酸敏感的保加利亚乳杆菌,但经过第一次传代,只有一株显示了对酸度敏感,而经过第二次传代,所有诱变的保加利亚乳杆菌菌珠对酸度敏感的特性都全部丧失。3.高活力乳酸菌的增殖培养根据优选L.b和S.t在经典培养基中生长,选定S.t和L.b增菌培养基的基质为:4%脱脂乳和5%的酶解乳清(水解时间60min,1:1配合)。通过增殖因子的单因素试验效果和正交试验确定增菌培养基(1)S.t最佳配方为:5%蕃茄汁、0.7%酵母粉、5%麦芽汁;2%乳糖、0.5%缬氨酸、1%碳酸钙。(2)L.b最佳配方为:5%番茄汁、5%麦芽汁、0.7%酵母粉;2%乳糖、70mg/kg甲酸。另外,补加10%Gq可以提高球菌的活力。控制发酵过程温度、pH值,对乳酸菌的产酸活性影响很大,其中球菌更适合在PH值较高(6.1)、温度为41℃条件下生长;杆菌更适合在pH值较低(5.7)、温度为41℃条件下生长。采用磷酸盐缓冲液在菌生长高峰期缓冲能力不能满足需要,不适合产酸量大的乳酸菌增殖。增菌过程充气体N_2、CO_2,对菌体并无提高。运用三因素二次饱和D-最优化设计(311A),得到球菌S.t培养条件的回归方程为:y=-83.07+2.40x_1+10.15x_2+0.99x_3+0.03x_1x_2-0.02x_1x_3+0.02x_2x_3-0.03x_1~2+0.03x_2~2-0.04x_3~2在培养温度41.8℃,pH值6.1、培养时间4.6h可获得最大产乳酸活力0.59%。运用三因素二次饱和D-最优化设计(311A),得到杆菌L.b培养条件回归方程为:y=-67.58-1.79x_1+9.57x_2+0.82x_3+0.02x_1x_2-0.01x_1x_3-0.02x_2x_3-0.02x_1~2-0.88x_2~2-0.04x_3~2在培养温度42.5℃、pH值5.9、培养时间4.7h,可获得最大产酸活力0.50%。按照优选增菌培养基和条件在全自动发酵罐中增菌,结果*上菌产酸活力在4h后下降;而SJ菌在增殖3.5~4h后,球菌的产酸活力下降。对增菌过程中菌体特征观察可以发现,在产酸活力达到最高之前(4h)L上为短而直的杆状,达到最高产酸活力后菌体为长而弯曲的杆状,并且在菌体内有着色不均匀的颗粒。将球、杆菌混合组成酸奶发酵剂,以球菌增菌4.sh、杆菌增菌3.sh发酵脱脂乳的产酸活力最高;另外,从各增菌阶段的杆菌与增菌4刀~4.sh的球菌混合其发酵活力无明显差别可以看出,杆菌的最初活力在实验范围内对酸奶发酵剂的活力影响不大。增菌培养基中增殖的发酵剂其产酸活力明显高于传统发酵剂的巾<0刀5),这证实实验所选的增菌培养基是有效的。将球菌和杆菌以初菌数1*比例混合在增菌培养基中,无论温度如何都遵循球菌先迅速生长,而在温度38C~44oC培养球菌数量始终占优势;Zh后杆菌比例增加趋于平衡,这一变化规律受培养温度影响,较高温度培养有利杆菌生长,而使球杆菌比例达到平衡的时间较短。较高pH值6刀有利于混合培养的总菌数增加,但是球菌杆菌比例不平衡,即球菌的数量远远高于杆菌;较低pH值培养总菌数低,但球杆菌比例随培养时间延长而趋向于平衡。4.营养物质及代谢产物对曹体生长的影响在发酵过程中乳糖消耗量约为中和用氢氧化钠的4倍,因此在乳酸菌增菌过程中根据NaOH的消耗量补加乳糖是必要的。补加乳糖量为:保加利亚乳杆菌(Lb)为碱量的4倍(按重量比)即可满足需要;而嗜热链球菌(S【)则在优选培养基之中再加 1%的乳糖,并在增菌过程中以4倍碱的量补加乳糖可获得更高的菌活力.将增菌发酵液分做抑菌试验,通过测定抑菌圈证实增菌过程中发酵液对菌体本身有抑制作用,这种抑制作用随着发酵时间的延长而增强:球菌在增菌培养基中发酵3刀h,杆菌在增菌培养基中发酵4h后其发酵液对自身菌的抑菌能力明显增强。通过添加 Ca(LC)。和 Na(LC)可知,中和剂对微生物菌体有抑制作用。同时 SDS-聚丙烯酚胺凝胶电泳分析发现在发酵液中有nisin成分的低分子蛋……   
[关键词]:乳酸菌;直投式发酵剂;菌种选育;增菌培养;保护剂;冷冻处理;共生
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:东北农业大学2002年