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原发性肝细胞癌中抑癌基因p33~(ING1b)的表达及其与p53基因间协同功能研究

祝峙

  抑癌基因是一类细胞生长的负调控基因,其正常功能失活是细胞恶性转化的重要启动因素。抑癌基因p53及其蛋白产物在细胞周期中发挥校正点功能,阻止损伤的DNA进行错配修复,从而防止细胞发生癌变。在原发性肝癌中,野生型p53基因失活是肝癌细胞发生发展的重要分子事件,p53基因丧失正常功能的原因除了p53基因结构突变导致产生突变型p53蛋白不能正常调节细胞生命活动外,另一个因素便是与p53功能相关的基因网络不能正常发挥功能。抑癌基因ING1编码蛋白p33~ING1b与野生型p53蛋白关系密切,两者共同参与调节许多细胞生命活动过程。p33~ING1b蛋白作为p53蛋白家族中的重要一员,研究其两者间的协同关系对阐明肝癌细胞的发生机制具有理论意义。本文用免疫组织化学方法观察了57例原发性肝癌组织(53例肝细胞癌,4例肝内胆管细胞癌)及配对癌旁肝组织中p33~ING1b与p53蛋白表达的相关性;检测了HBV在肝癌及癌旁组织中的感染率,分析HBV X蛋白与p33~ING1b及p53蛋白表达的相关性;应用PCR-SSCP及DNA测序检测了p33~ING1b基因在原发性肝细胞癌中的突变频率;将p33~ING1b cDNA 克隆入PCDNA3真核表达载体,并将其转染入人肝癌细胞株SMMU7721,观察了SMMU7721细胞的生长速度,细胞凋亡情况及软琼脂克隆形成率的变化;为了进一步研究p33~ING1b与p53间的协同功能对肝癌细胞生物学行为的影响,选取三株内源性p53表达状态不同的肝癌细胞株,转染入p33~ING1b基因及野生型p53基因,观察了联合共转染两基因及单转染基因组间三株肝癌细胞凋亡率、细胞周期G0/G1阻滞率及p53下游基因p21~WAF1的激活强度变化,并用Western免疫印迹方法比较了三株肝癌细胞在转染后p33~ING1b与p53蛋白表达水平的差异;主要结果如下:1、 57例原发性肝癌组织中p33~ING1b及p53蛋白表达阳性率分别为42.1%和57.9%,两者阳性分布区域相同,均定位于细胞核内,p33~ING1b与p53蛋白在肝癌组织中表达呈显著正相关(P<0.01);在13例癌旁肝组织(13/51)及2例正常肝组织(2/12)中p33~ING1b弱阳性表达,且呈不均匀散在分布,而所有癌旁肝组织及正常肝组织中p53均呈阴性,提示p33~ING1b可能还存在其它不依赖p53的表达途径。HBV感染是影响肝细胞中wtp53正常发挥功能的重要因素,HBV X蛋白的表达在肝癌组织中与p53蛋白及p33~ING1b蛋白表达均呈显著相关,提示HBV X蛋白可能在p53及p33~ING1b蛋白的协同作用中有影响。2、PCR-SSCP及DNA测序结果表明p33~ING1b基因在肝癌组织中没有大片段的插入或缺失,5例肝癌组织经SSCP检测出现异常迁移或多带,DNA测序证实其中2例(7.1%)在ING1b基因外显子2区内存在点突变;在癌旁肝组织中ING1b基因均未发现突变;ING1b基因低突变率提示在肝癌组织中ING1b基因丧失正常抑癌功能,基因突变不是主要原因。3、 人肝癌细胞株SMMU7721在转染了p33~ING1b基因表达质粒后,细胞生长速度明显减慢,细胞凋亡率上升,在软琼脂培养基上的克隆形成率也明显下降;将细胞内源性p33~ING1b用反义核苷酸封闭后,细胞凋亡率比转染空载体对照组下降,软琼脂克隆形成率明显上升,表明过表达p33ING1b基因能有效抑制肝癌细胞的生长并且能阻止癌细胞的恶性转化,提出p33~ING1b真核质粒表达载体可能作为肝癌基因治疗的新手段。4、 在三株内源性p53表达状态不同的肝癌细胞中,观察p33~ING1b与p53间的协同功能,Western免疫印迹结果显示在SMMU7721细胞中,过表达外源性p33~ING1b基因实验组,其内源性wtp53蛋白表达显著高于对照组;在内源性p53蛋白呈突变型的PLC/PRF/5肝癌细胞及内源性p53蛋白完全缺失的Hep3B肝癌细胞中则没有观察到此现象,提示p33~ING1b蛋白与wtp53蛋白表达关系密切;脂质体转染实验显示,p33~ING1b基因与wtp53基因联合作用组比单基因作用组的细胞凋亡率、G0/G1期阻滞细胞数及对p53下游基因p21~WAF1的激活强度均显著升高,且这一作用在化学诱导剂的作用下得到进一步加强,提示p33~ING1b与wtp53基因发挥协同功能需要二者的共同参与,当它们其中的一个失活,另外一个都不能单独有效发挥抑癌功能;但这一协同作用可能还有其它因素干扰,在存在HBV感染的PLC/PRF/5细胞及Rb抑癌基因缺失的Hep3B细胞中,p33~ING1b与wtp53联合作用组的细胞凋亡率及G0/G1期阻滞与对照组没有观察到明显差别,提示HBV感染及Rb抑癌基因可能会影响p33~ING1b与wtp53间的协同功能,进一步的研究有助于阐明在肝癌发病机制中这些基因间的相互作用。……