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嗜水气单胞菌侵袭机制及其胞外蛋白酶的研究

储卫华

  致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)是我国淡水养殖鱼类的重要病原对其侵袭机制和毒力因子的研究有重要的意义。本文对我国分离的致病性嗜水气单胞菌AhJ-1株在体内、体外的侵袭机制以及其重要的毒力因子—胞外蛋白酶的产生条件,蛋白酶的致病性,蛋白酶的结构与功能之间的关系,蛋白酶的同源性以及结构预测进行了研究,并建立了一种检测致病性嗜水气单胞菌的PCR方法。1 用HEp-2细胞和异育银鲫作为细胞和动物模型,对嗜水气单胞菌AhJ-1株的侵袭机制进行了体内和体外研究。采用庆大霉素裂解培养法对嗜水气单胞菌鱼源株AhJ-1对HEp-2细胞的侵袭特性进行了研究.结果显示,AhJ-1在4℃时不具有侵袭力,在37℃时对HEp-2细胞的侵袭率达到0.2%;细菌在细胞内能增殖;细胞松弛素D和酪氨酸蛋白激酶抑制剂能抑制AhJ-1的侵袭,而酪氨酸蛋白磷酸化酶抑制剂却能促进AhJ-1对HEp-2细胞的侵袭,Ca~(2+)通道阻断剂对AhJ-1的侵袭力影响不大。表明AhJ-1对HEp-2具有侵袭力,且与温度有关,信号转导,细胞骨架参与了侵袭过程.将绿色荧光质粒转化到AhJ-1株中,通过浸泡的方式对人工创伤、去除粘液,以及正常异育银鲫进行感染,结果发现创伤组和去除粘液组在感染后24h,其各器官的含菌量均高于对照组,说明伤口、皮肤是嗜水气单胞菌的感染途径,天然屏障在鱼类免疫中起重要作用。2 对体外培养嗜水气单胞菌的胞外蛋白酶(ECPase)产生条件进行了优化。结果发现,其产量与碳源、氮源、培养温度、培养基初始pH值等有关。蔗糖能促进蛋白酶的产生,NH_4~+抑制蛋白酶的产生。其最佳产酶条件为:pH7.5的0.02mol/L KCl,0.06mol/L K_2HPO_4,5g·L~(-1)的蔗糖和5g·L~(-1)的胰蛋白胨水,28℃,150r·min~(-1)摇床培养65h。在此条件下酶活性可达20.8U·mL~(-1)。3 以提纯的嗜水气单胞菌胞外蛋白酶(ECPase)注射异育银鲫,鲫鱼出现典型的由嗜水气单胞菌引起的败血症症状。病鱼体表充血、出血,鳃苍白,腹部膨大,肛门红肿突出,腹腔内有红色的腹水,肠壁充血发炎。背部肌肉注射部位发生液化、糜烂,鳞片竖起。病鱼各组织器官都有病变,其中尤以肝、肾最为严重。肝脏肿大,质地脆弱,肝细胞水肿,胞浆结构疏松。肾小体坏死以至解体,肾小管上皮细胞也发生病变.体外试验表明,正常鲫鱼血清中有某种成分能够抑制蛋白酶的活性。4 以携带质粒pAM120(Ap~r、Tc~r/Tn916)的大肠杆菌(E.coli)CG120株为供摘要体菌,与受体菌嗜水气单胞菌Jl株,采用滤膜接合法进行接合转移,在选择平板(含To、。fi和脱脂奶)上进行筛选,筛选出6株蛋白酗失株(ECPase勺,ECPase”菌株其生长速度,对正常鲫鱼血清的杭性降低,用脱脂奶平板法及底物法检测,蛋白酶产量明显降低。与亲本J八比,突变株致病力降低,对鲫鱼的半数致死量大于 10’U上株对鲫鱼的半数致死量为5 x 10勺。用ECPase”突变株 MJJ株的18h培养物u x10吐FU)接种健康鲫鱼,不产生亲本Jl株引起的病变及死亡。用 MJ刁活菌免疫鲫鱼,在第5周产生较高的凝集杭体,且对强毒株J二的攻击有保护作用。表明蛋白酶是嗜水气单胞菌的一个重要的毒力因子,ECPase”突变株仍具有免疫原性。5蛋白酶是嗜水气单胞菌的重要致病因子,为研究其结构与功能之间的关系,用DEPC、EDC、PMSF、N-AI等9种化学修饰剂处理嗜水气单胞菌J1株胞外蛋白酶ECPase54,然后检测残余酶活力,借以研究酶分子中贻酸侧链基团与酶活性中心的关系。结果表明,抛、丝氨酸、。躺、孤基等残基与酶活性无关;半跳氨酸残基与酶活性也无直接关系;而色氨酸、组氨酸、酪氨酸残基侧链以及二在剂建的化学修饰弓】起酶活性的大幅度的下降,说明色氨酸、组氨酸、酪氨酸残基以及二ha.Mr是酶活力所必需的基团。6才瞄已发表的气单胞菌胞外蛋白酶基因核旮晰列,设计和合成了一对引物,以嗜水气单胞菌Ah上的基因组DNA为模板,通过PCR技术,扩增得到一gil hp的丝氨酸蛋白酶片段,并与pGEM1载体克隆连接,测序,进一步对扩增的丝氨酸蛋白酶基因片段进行分析,发现与发表的嗜水气单胞菌丝氨酸蛋白酶AheZ的同源性有87%,扩增片段编码343个躺酸,分子量为35700,有较高的抗原性。7fR4&已发表的16siJNA基困序列气溶素基因序列,设计 T2对引物,建立了检测致病性嗜水气单胞菌的PCR方法。通过对 12株气单胞菌的检测,发现 16s rDNA引物具有高度的特异性,仅对嗜水气单胞菌扩增阳性,而气溶素引物检测结果与采用生物学方法检测的结果相一致,且具有高度的敏感性,可检测最低lfg的模板。该方法的建立为致病性嗜水气单胞菌的检测提供了一种简便、快速的途径,是一种比较实用的致病性嗜水气单胞菌的检测方法。……   
[关键词]:嗜水气单胞菌;侵袭;胞外蛋白酶;致病性;检测
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:南京农业大学2002年