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疫霉90 kD蛋白激发子诱导过敏反应和系统获得抗性分子机制研究

张正光

  本文就棉疫病菌(Phytophthora boehmeriae Saw.)分泌的90 kD胞外蛋白激发子的生物活性及其稳定性、诱导烟草系统获得抗性、细胞过敏性死亡、防卫反应酶和H_2O_2与SA(salicylic acid)两信号分子在该激发子诱导烟草HR与SAR中的作用及其两信号分子之间的相互关系进行了研究。对该胞外蛋白激发子的生物活性与稳定性进行了研究。用不同浓度的激发子处理烟叶测定其诱发过敏反应(hypersensitive response,HR)的有效浓度,结果是所测定的0.5~100 nmol/L各浓度均可诱发HR,但100 pmol/L不能诱发HR,表明该激发子诱导烟草产生过敏反应的最低有效浓度在100 pmol/L~0.5 nmol/L之间。该激发子可诱导不同烟草(Nicotiana tobacum L.)品种产生过敏反应,但不能诱导辣椒(Capsicum annuum L.)和茄子(Solanum melongena L.)等茄科作物及棉花(Gossypium arboreum Linn.)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)和油菜(Brassia campestris)发生过敏反应,初步表明该激发子诱导植物发生HR具有一定的专化性。以10 nmol/L激发子溶液处理烟叶后分别于第0、24、48和72 h接种烟草疫霉(Phytophthora nicotianae),结果证明该激发子可以诱导烟草产生抗性反应,其抗性以处理后立即接种烟草疫霉为最强,接种后48 h防效达68%,以后随时间的延长逐渐减弱。激发子分别经pH值2~14的水溶液25℃处理30 min、或分别经4、25、60和100℃处理5 min仍能诱发过敏反应,但是经蛋白酶K处理后不能诱发HR。表明该激发子对酸、碱和温度不敏感,但对蛋白酶K敏感。就该蛋白激发子诱发烟草系统获得抗性(systemic acquired resistance,SAR)进行了研究。以10 nmol/L激发子溶液注射处理Samsun NN烟草叶片24 h后,在处理叶片及其上、下各2片叶片接种TMV,结果是处理叶及其上、下各2片叶片上的枯斑数显著少于对照,诱抗防效达40.9%~53.1%;接种TMV 7 d后处理叶片的枯斑平均直径为1.23mm,显著小于对照叶片上的枯斑直径2.97mm,但是处理叶片的上、下叶片上的枯斑平均直径与对照没有显著差别。以10nmol/L激发子溶液注射处理Samsun NN烟草叶片分别立即接种或于1、2、4、7、15 d接种TMV,结果证明该激发子诱导烟草对TMV的抗性以处理后第1 d至第4 d接种为较好,防效达30.2%~50.4%;处理后立即接种和第7 d接种TMV诱抗防效仅4%左右,处理叶片上的枯斑数与对照没有显著差别,表明较强的诱导抗性可持续时间<7d。用不同浓度激发子处理烟叶,所测定的0.5~100nmol/L各浓度均可显著地诱发烟草对TMV产生获得抗性,诱导抗性效果为34.9%~58.2%,诱导抗性效果随浓度的降低呈下降趋势。以10 nmol/L激发子溶液注射处理W38烟草叶片,2d后分别注射接种烟草野火病菌(Pseudomonas中 文摘翌Syringae pv.tabaci)菌液或喷雾接种烟草赤星病菌(Alternari alternata)分生抱子,结果是,注射接种烟草野火病菌sd后处理叶片及其上、下叶片上的野火病病斑均显著小于对照;处理叶片上的赤星病病斑数及病斑面积明显小于对照,表明该激发子可诱导烟草对野火病和赤星病产生抗性。上述结果表明,90 kD蛋白激发子诱导烟草产生的获得抗性是一种典型的SAR。该系统获得抗性对病原菌具广谱抗性。就该90 kD胞外蛋白激发子诱导y过程中细胞死亡和防卫反应酶系活性变化及病程相关蛋白PRS的诱导进行研究。结果是,以10nmol/L激发子溶液注射处理W3 8烟草叶片,HR枯斑周围5mm宽组织在UV光下呈现蓝色荧光,对处理部位进行Evans blue染色测定结果是至20 h处理部位细胞全部死亡;激发子可诱导烟草防卫反应中苯丙氨酸解氨酶(PA)的活性提高;可诱导 PR* 和 PRS基因的转录。上述结果表明90 kD蛋白激发子可诱发烟草的细胞死亡、苯丙烷代谢和PR基因的表达等多条信号途径。就H。O。在该90 kD蛋白激发子诱发烟草 HR和SAR中的作用进行了研究。以10nmol/L激发子溶液注射处理野生型烟草征el-W3叶片后,分别于不同时刻测定处理叶片及其上、下叶片中Hp。的含量及处理部位过敏性细胞死亡动态,结果是处理叶片及其上、下叶片在24 h内均能发生2次氧化迸发产生H。O。,处理部位细胞死亡高峰期滞后第二次 H。O。迸发高峰期 8 h。己有的研究证明抗坏血酸过氧化物酶…scrobateperoxidase,APX)对生物体清除Hp。维持自身的氧化还原平衡具有重要作用。为了进一步从遗传学角度证明H。O。在90 kD蛋白激发子诱发烟草HR和 SAR中的作用,分别以HR剂量和非HR剂量处理反义抑制APX表达的转基因烟草及其野生型测定HR。结果是,HR剂量的激发子诱发烟草的过敏性坏死枯斑比野生型出现早,且枯斑比野生型烟草大;不能诱发野生型烟草HR的剂量可以诱导反义抑制APX表达的烟草发生HR。以10nmol几激发子溶液注射处理反义抑制APX表达的烟草及其野生型烟草12h后磨擦接种Pnicotianae和TMV,结果显示,经激发子处理后反义抑制APX表达的烟草对P nicotianae和 TMV产生的诱导抗性比野生型高。上述结果表明清除H。O。的APX被抑?……   
[关键词]:90kD蛋白激发子;过敏反应;系统获得抗性;过氧化氢;水杨酸
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:南京农业大学2002年