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伪狂犬病病毒gE基因的表达及初步应用

蒋鹤春

  伪狂犬病是危害世界养猪业的一类烈性传染病,每年在世界范围内造成巨大的经济损失。鉴于伪狂犬病的巨大危害,欧洲许多国家相继使用了标记疫苗和启动了“根除计划”。目前该病在我国流行亦相当广泛,我国在该病控制上采取了相似的措施,TK/gE双基因缺失苗使用和相应鉴别诊断方法的建立,是这一措施的要求,通过基因工程的方法生产诊断抗原又是建立鉴别诊断方法的要求。用BamHⅠ和HindⅢ将gE全基因从gE全基因克隆载体pgE中切出,连接进PET-32c表达载体,双酶切和PCR鉴定出阳性者,命名为PET-32wgE,转化BL21菌株,挑取单菌落在加有氨苄的2×YT培养基中37℃过夜长至饱和,按2%体积转种另一管,培养至OD_(600)为0.6,加IPTG至终浓度1mmol/l,IPTG诱导4~6小时,SDS-PAGE和Western blot分析,未发现特异条带。设计一对引物从gE全基因克隆载体pgE中调出抗原决定簇密集编码区,克隆进PET-32a表达载体,双酶切和PCR鉴定出阳性者,命名为PET-32pgE,转化BL21菌株,挑取单菌落在加有氨苄的2×YT培养基中37℃过夜长至饱和,按2%体积转种另一管,培养至OD_(600)为0.6,加IPTG至终浓度1mmol/l,诱导4~6小时,SDS-PAGE和Westernblot分析,证明确实表达并具有免疫反应性。有机溶剂提纯法和组氨酸柱提纯法提纯表达产物,包聚苯乙烯板行间接ELISA检测待检血清效果较好,用提纯的蛋白致敏乳胶,检测待检血清,空白对照和阴性对照也出现轻度的凝集,但阳性血清凝集明显。用BamHⅠ和XsolⅠ将gE全基因从PET-32wgE中切出,与同样的酶处理的pSecTagHygroC真核分泌表达载体连接,双酶切和PCR鉴定出阳性者,命名为pSecTaggE。转染长成大半满瓶的Vero细胞,继续生长60小时,收集细胞和培养液,SDS-PAGE和Western-blot分析,未发现特异条带,将上清1:2稀释包被聚苯乙烯板行间接ELISA,发现上清中有表达的分泌产物。细胞的分泌表达简化了烦琐的纯化步骤,使蛋白的免疫原性和免疫反应性几乎得以完全保留,如能减少非特异性并筛选出稳定的表达株则不失为一种好的检测抗原生产方法。……   
[关键词]:伪狂犬病病毒;表达;提纯;检测
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:南京农业大学2002年