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E.coli中高效表达外源蛋白的探索及其在纳豆激酶中的应用

宋照雷

  目的:针对目前基因工程发酵生产中一些外源蛋白表达量过低的问题,寻找一种切实可行的方法能高效表达这些外源蛋白。目前基因工程发酵生产的方法一般是按照分子克隆的方法,将一段外源基因克隆到一种表达载体中,然后转化到大肠杆菌中进行发酵生产。但经常会出现表达量太低或者根本不表达的情况。尤其在大规模的工业化生产中,对于表达水平有较高要求,必须有高表达的菌株才能产生规模效益。对决定表达水平的一些重要因素以及相关的构建上的一些方法作一些研究,对于以研究为目的所需或者工业化生产各种外源蛋白,且对于继续探索在酵母细胞、哺乳动物细胞等真核细胞中高效表达外源蛋白都有十分重大的意义。材料和方法:以本所正在开发的产品——纳豆激酶作为试验对象来试验本课题中所研究的新方法的实用性。主要考虑两种因素:翻译起始区(TIR)的自由能及大肠杆菌的密码子偏好性。按照最大可能增大TIR区自由能和最大可能符合大肠杆菌密码子偏好性的原则,利用摇摆碱基的特性,对外源基因前35个碱基的一些摇摆碱基位点进行突变。G+C含量是决定TIR区标准自由能变化(△G~0)的决定性因素,降低G+C含量即可增大TIR区△G~0。在一些碱基位点上,以上两个原则发生冲突时,此位点摇摆碱基随机化,随机化的结果将产生很多种序列组合。用计算机软件DNASIS2.5分析每种组合TIR区自由能,计算其△G~0,按△G~0高低排序,选取前10条序列设计10条长引物。此长引物包含各个突变的位点的一种组合。用这种长引物和共同的下游引物进行PCR扩增,然后按分子克隆的一毕业论义:ECOli中高效表达外源蛋囱的探索及几介纳豆激酶中的应mMS般方法,分别进行克隆,转化到10块平板上,分别酶切检测出构建成功的克隆,SDS—PAGE测定其目标蛋白产量,选取1株高表达菌株摇瓶扩大生长。纳豆激酶和纳豆激酶原都用包涵体复性的方法,然后川CLT ik检测其纤溶活性,Superdex200凝胶过滤层析法层析纯化,并测定重组于DNA序列。结果:1.用以上所述构建方法,对于纳豆激酶原和纳豆激酶都得到表达量高于总蛋白量30%的高表达菌株。从转化平板验证各种重组子克险,纳豆激酶原有1株表达量高于30o,纳豆激酶有3株表达量高于30O。2.生物活性检测小,纳豆激酶原和纳豆激酶都表现出纤溶活性。3.凝胶过滤层析方法进行分离提纯,效果显著,纯度达96%左右。4.测序结火证u重纠了序列是正确的。结论:密码于偏好州Z及翻译起始区(TIR)自山能是决定翻译水平的重要因素,而G + C含量是诀定RNA二级结构自山能的决定性因素。根孤摇摆碱基的特性,改变摇摆碱基从而减少G十C含量,增加密码于偏好性。按此原则设计引物构建克隆将是一种迅速得到高表达菌株的可靠方法。***SISZ.5的计算结果和实验得到的结果一定程度上吻合,暗示计算机辅助分析在将来此类型的研究工作中将扮演更重要角色,但山于目前有关*R区二级结构及三级结构的形成机制及能量参数还不完全明确,计算机软件巡算结果只能作为一种圳助。……   
[关键词]:翻译起始区;高效表达;大肠杆菌;纳豆激酶;软件分析
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:暨南大学2002年