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伪狂犬病病毒gE糖蛋白基因的克隆、测序及真核表达质粒的构建

吴发兴

  以中国兽药监察所分离、鉴定的中国伪狂犬病病毒(Pseudorabies vires,PRV)主要流行标准毒株Min-A株为实验材料,接种已长成单层的PK-15细胞增殖病毒。待85%的细胞出现细胞病变后收获细胞。将收获的细胞经-20℃和37℃反复3次冻融后,超声粉碎,低速离心收集上清液,再以超速离收获病毒。用专用试剂盒提取病毒基因组DNA,作为gE PCR扩增的模板;参照已公开发表的PRV-Rice株gE基因的序列设计了一对用于特异性扩增gE基因的引物,经PCR扩增后得到了大小约1.7kb的条带。用T_4DNA连接酶使gE基因与经BamHI、KpnI同样双酶切的pUC19质粒DNA连接;用连接产物转化大肠杆菌JMl09感受态细胞,置含Amp、X-gal和IPTG的LB平板上培养12~20小时;挑取白色菌落于选择性培养基扩大培养,碱裂解法小量提取质粒DNA,并进行酶切分析鉴定,结果获得整合有PRV gE基因的重组质粒pUgE DNA,并与其它PRV分离株进行gE基因序列同源性分析。将重组质粒pUgE DNA与转移载体pFastBacl DNA用BamHI和EcoRI双酶切处理,T_4DNA连接酶连接,用连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞,得到重组转移载体质粒pFastBac-gE DNA。重组转移载体转化含穿梭载体Bacmid的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,于选择性平板上37℃培养,挑取发生转座作用生成的白色菌落,于选择性培养基中扩大培养,碱裂解法小量提取重组Bacmid DNA,并做酶切分析鉴定,命名为rBacmid-gE DNA。将纯化的rBacmid-gE DNA用Ca_3(PO_4)_2沉淀法转染昆虫细胞sf9,收集转染细胞,500g低速离心后,上清即为收获的重组病毒液,命名为rvBac-gE。对重组病毒进行PCR鉴定,电泳结果显示扩增片段的大小与预期值相符,gE基因重组、克隆正确。为下一步进行gE基因的表达、为建立PRV强、弱毒鉴别诊断gE-ELISA方法奠定了物质基础。……   
[关键词]:PRV-MinA株;gE基因;Bac-to-Bac系统;克隆;序列分析;真核表达质粒
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:西北农林科技大学2002年