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珊瑚藻藻红蛋白的分离纯化与相关特性

王盛

  在福建沿海地区采集了数量可观的天然大型藻类,经粗提液可见光光谱特性筛选(400~700nm),从中找到三种极为特殊的大型红藻,其藻体中仅含有R-藻红蛋白(R-Phycoerythrin,R-PE)。通过进一步的比较分析,选择在福建沿海广为分布且周年可以生长的珊瑚藻(Corallina officinalis)作为实验材料。经盐析、离子交换层析、羟基磷灰石吸附层析和凝胶过滤层析等分离纯化方法,从珊瑚藻中分离纯化出两种藻红蛋白(R-PE和r-PE),其中R-PE纯度(OD_(565)/OD_(280))高达11左右,是目前国内外报道的藻红蛋白中纯度最高。对R-PE部分理化特性的研究结果表明,R-PE的分子量为194kD,与目前报道的多数R-藻红蛋白240kD的分子量不同;其α、β亚基分子量均为20kD左右,γ亚基分子量约为31kD,理论推测的R-PE亚基组成为(α β)_4γ,与前人报道的(α β)_6γ不同,而且其是否存在第四亚基还有待进一步证明;同时在变性条件下对R-PE的各亚基进行了分离纯化并对其各亚基可见光光谱特性作了研究。在R-PE与r-PE部分理化特性的比较研究中发现,在亚基组成上r-PE比R-PE缺失了31kD的γ亚基;在可见光光谱学特征方面,其最大吸收峰也比R-PE蓝移了10nm;在荧光光谱上,两者在荧光激发峰和发射峰的位置和荧光强度上也存在差异;通过比较讨论,对r-PE在藻胆体结构组成中可能的作用作了推测。在BCA法进行蛋白质定量的基础上,测定了R-PE的565nm和280nm的摩尔消光系数,它们分别为4.75×10~5mol~(-1)cm~(-1)和4.07×10~4mol~(-1)cm~(-1)。制备了R-PE的抗血清并对血清效价进行了测定,同时用Western-blot对血清特异性作了评价。首次测定了珊瑚藻藻红蛋白α和β亚基基因的全序列(GenBank登录号:AF510986),测定的基因序列长为1,140个碱基,包括β亚基起始密码子上游的10个碱基,6亚基编码区的534个碱基(编码177个氨基酸),101个碱基的间隔区以及α亚基编码区近5’端的495个碱基(编码164个氨基酸)。对其序列特征、各亚基在核酸和氨基酸水平上的同源性与已知基因序列的9种真核红藻作了比较分析。在比较分析结果的基础上,认为α和β亚基可以作为红藻分子生物学分类的标准之一。并对其γ亚基N-端的氨基酸进行了测定,测定的氨基酸序列在已知蛋白序列中未找到同源序列。以双功能试剂SPDP为交联剂,从珊瑚藻中纯化的R-PE和购买的离子交福建农林人学博1:学位论文2二换纯化的羊抗兔抗体为标记材料,利用两步标记法获得藻红蛋白抡疫荧光探针。引用渗滤法免疫试剂盒中常用的固相载体一硝酸纤维素膜为固相载体,同时引用 DotELISA的操作试剂和方法,以烟草花叶病毒(TObacco mosaicvIYus,TMV)为试验检测对象,用两种荧光免疫分析方法进行了初步的应用研究,并对四种不同的免疫分析方法的灵敏度作了比较。对如何进一步提高藻红蛋白介导的免疫荧光分析方法的灵敏度作了深入的分析和讨论。……   
[关键词]:珊瑚藻;藻红蛋白;基因克隆;序列分析;免疫荧光分析
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:福建农林大学2002年