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肝外DHBV复制治疗学意义及中药体外抗肝纤维化筛选平台的探讨

谈博

  慢性乙型肝炎的防治研究一直是肝病研究的重大课题。抗病毒治疗仍然是慢性乙型肝炎治疗的重点和主攻方向。完全地、彻底地清除肝炎病毒是最有效的缓解肝脏炎症和减少诸如肝硬化、肝癌等严重并发症的治疗策略。在慢性乙肝领域应用核苷类似物进行治疗时普遍存在经过12-18个月治疗,停药后出现血清HBV DNA有复燃的迹象,即常说的“停药后反跳”。目前慢性乙型肝炎的治疗方案的疗效均不甚理想,很难根治或杜绝相关的并发症的发生。研究者便通过研究抗肝纤维化试图减少或延缓肝硬化的发生发展。肝纤维化是向肝硬化发展的中间环节,人们对肝纤维化在分子细胞水平进行了深入研究。肝纤维化发展过程,特别是肝星状细胞激活、表型转化、增殖等几乎每一个变化都有不同的细胞因子参与调节,这些细胞因子通过各自不同的细胞信号转导通路发挥作用,产生特有的细胞效应。而这一复杂的病理过程由细胞因子网络所调节。本文从肝外器官DHBV复制的角度探讨乙肝抗病毒治疗的“停药后反跳”中已存在和待重视的问题,以有裨益于今后的治疗研究。同时本文探讨中药抗肝纤维化体外细胞筛选平台的构建并试图探讨TGF-β的调节与药物抑制细胞增殖之间可能存在的联系,为后续研究提供行之有效的方法学支撑。本课题第一部分研究应用鸭乙型肝炎模型,应用组织DHBV-DNA斑点杂交与PCR检测研究肝及肝外组织器官病毒,进行药物(ACV和3TC)治疗过程中血清病毒载量的动态观察,并进行肝及肝外组织器官病理学研究。实验结果:经过一系列的实验以优化反应成分,获得DHBV-DNA的PCR方法的优化结果;经x~2检验,发现检验组织中DHBV-DNA方面,DHBV-DNA斑点杂交与PCR两种方法之间存在显著性差异(P<0.01),PCR法优于斑点杂交法;不同组织中DHBV DNA的分布在病毒对照组和药物治疗组中不存在统计学差异(P>0.05),也即核苷类似物的抗病毒治疗不能彻底清除肝脏和肝外组织中的DHBV-DNA;病理研究显示病毒对照组肝细胞明显变性,浊肿、空胞变、核固缩等,汇管区周围炎症细胞浸润,ACV组和3TC组炎症程度明显减轻,而肝细胞固缩、空胞变的情况也较多见,说明药物治疗组仍然有利于肝组织炎症的缓解,但是肝细胞固中 文摘要一缩、空胞变的的原因尚有待进一步探讨。病毒对照组、ACV组和 3TC组均存在不同程度的肾小管细胞和肾小球细胞浊肿、空泡变、固缩,肾间质性炎症,局部淋巴细胞浸润;脾生发中心细胞固缩,有类淀粉样物质沉积;心、肺组织基本正常。本部分研究结果表明:对于血清病毒指标而言,PCR和斑点杂交的结果基本一致,但是,在检测组织中病毒指标时,斑点杂交远不如 PCR敏感,存在较多的假阴性结果。因此,在这种情况下不应采用斑点杂交检测DHBV-DNA。肝外组织中存在病毒复制,但其复制不如在肝脏中活跃。其原因可能是肝外组织中病毒的低水平复制,才导致免疫细胞无法识别而清除之;而且从药代动力学来考虑,药物在这些组织的浓度较低不足以完全清除病毒,甚至于可能成为病毒变异株产生的场所。核昔类似物的实验治疗也不能清除在肝及肝外组织中的DHBV-DNA。组织中的DHBV-DNA不像血清DHBV-DNA会伴随药物治疗而快速变化,而是相对比较稳定,可考虑作为评价药物长期疗效的指标。本课题第二部分探讨中药抗肝纤维化体外细胞筛选平台的构建,拟在探讨构建抗肝纤维化中药的体外细胞筛选平台的有关思路和技术方法,从方法学角度反思中药抗肝纤维化的研究。实验采用HSC16细胞作为受试对象,选择HSC细胞增殖作为效应指标,并结合血清药理学方法研究丹参这个单味药;我们随后研究了川苇唉、苦参碱H个中药单体对HSC—T6细胞增殖的影响;实验还进一步探讨川草嗓对HSC16细胞SMAD蛋白细胞内易位的影响,试图从细胞信号转导通路及细胞因子的调节作用探讨肝纤维化发展过程及中药发挥治疗作用的深层次的机理。实验结果:*S*16的细胞生长曲线有明显的增殖迟滞期(叶8N,HSC-T6细胞的克隆形成率为82.4%;含丹参血清抑制HSC细胞增殖作用呈剂量依赖性,各剂量组的OD57。值与对照组相比,均具有显著性差异炉<0、05);苦参碱抑制 HSC细胞增殖作用呈剂量依赖性,10“乙10“‘ill*几各剂量组的 ODn。值与对照组相比,均具有显著性差异o<0刀5);川穹嗓抑制*SC细胞增殖作用呈剂量依赖性,10’\10”‘m*几各剂量组的 ODS刀值与对照组相比,均具有显著性差异O吻.05);经过川穹喷作用Zh后,免疫荧光检测显示川穹喷并未影响*SCT6细胞内 SMAD蛋白kmad之和 smad一)的易位变化,说明没有发生 TGF卡的细胞内信号转导。4肝外DHBV复制治疗学意义及中药体外抗肝纤维化筛选平台的探讨第二部分研究结果表明:以HSC丁6细胞增殖作为效应指标和以含药血清和中药单体作为样品所构建的抗肝纤维化体外细胞模型(药物筛选平台)具有所需样品量少,实验周期短,并且药物作用靶点(HSC丁6细胞增殖)明确等……   
[关键词]:慢性乙型肝炎;肝外器官;肝纤维化;中药;TGF-β;SMAD蛋白;筛选平台
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:广州中医药大学2002年