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补肾化痰中药对慢性支气管炎动物模型神经—内分泌—免疫网络的影响

王淑玲

  目的:本课题的研究目的主要为:1观察雄激素受体(AR)在雄性大鼠、小鼠气管和肺中的表达寻找中医学“肺肾相生”、“肾主纳气”的物质基础,并为补肾法防治慢性支气管炎提供依据。2观察香烟烟雾吸入造成的雄性大鼠、小鼠慢性支气管炎模型神经-内分泌-免疫网络的变化探讨慢性支气管炎的发病机制。3观察补肾化痰中药对烟熏慢性支气管炎动物模型神经-内分泌-免疫网络的影响,探讨补肾化痰中药防治慢支的作用机制。方法:实验一:雄激素受体(AR)mRNA在正常雄性小鼠气管和肺组织中的表达正常雄性小鼠10只,氯胺酮(3mg/kg,腹腔注射)麻醉后剖取气管、肺和睾丸组织(所有器械均经过灭活RNA酶的处理),迅速置液氮中冷冻保存。异硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步法提取总RNA,并采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及TaqMan技术实时荧光定量检测小鼠气管、肺和睾丸组织中雄激素受体(AR)mRNA的表达,ARmRNA表达量由ABI PRISM 7700 Sequence Detection System直接测定。AR引物序列为:5′-TTACAGCAGAGGCAGGAGACT-3′5′-TGGGGCAGCTGAGTCATCCT-3′荧光探针序列为:5′-FAM CCACCCTGAGAGCAGCTGCCTDABYCLE-3′实验二:雄激素受体(AR)在正常雄性大鼠气管和肺组织中的定位研究健康雄性Wistar大鼠10只,氯胺酮(3mg/kg,腹腔注射)麻醉后剖开胸腔,经心脏进行生理盐水灌注致肺脏完全变白,剖取气管、肺和睾丸,置4%的多聚甲醛中固定24h,取材后入25%的蔗糖浸泡中文摘要过夜,恒冷切片,厚度8 11m,采用免疫组织化学LABSA法染色,以大鼠睾丸组织标本作为阳性对照,用PB S代替一抗作为阴性对照,光镜下观察AR的表达,以细胞浆或核内出现棕黄色颗粒为阳性表达。采用HPIA刁高清晰度彩色病理图文分析系统测定阳性细胞的平均灰度和平均光度,测定气管和肺组织中AR的相对含量。实验三:香烟烟雾吸人法妄制慢性支气管炎动物摸型及分组给药方洁昆明种健康雄性小鼠60只,体重18《,随机均分为5组,即正常对照组、慢支模型组、补肾化痰大剂量组、补肾化痰小剂量组和桂龙咳喘宁组,除正常对照组外,其余4组置烟熏箱巧5cm X 50cmX 45cm)中进行香烟烟雾吸入,4支/次,2 次用,连续30d,而后改为1次用,连续30d,共计60d。除慢支模型组外,其余3组均于烟熏的第一大开始分别按规定剂量进行灌胃给药,正常对照组和慢支模型组均灌胃生理盐水,连续60d。于第61大全部处死。健康雄性Wistar大鼠72只,体重180上,随机均分为6组,即正常对照组/慢支模型组、补肾化痰大剂量组、补肾化痰小剂量组、气管炎咳嗽痰喘丸组和自然恢复组。除正常对照组外,其余5组置烟熏箱 门 XI 50cm X 110cm)中进行香烟烟雾吸入,64支/次,2次吐,连续 38d,而后改为 1次M,连续 38d,共计 76d。慢支模型组于烟熏结柬后的当大处死。补肾化痰大、小剂量组和气管炎咳嗽痰喘丸组于烟熏结束后分别按规定剂量灌胃药物,正常对照组和自然恢复组均灌胃生理盐水,连续3 cd,于灌胃开始的第引天全部处死。实验四:补肾化痰中药对烟熏慢支动物模型病理组织学的影响剖取气管、肺组织,置4%的甲醛溶液中固定24h,取材、乙醇梯度脱水、石蜡包埋、4刁 11m切片,HE染色,光镜下观察各组小鼠和各组大鼠气管及肺组织的病理组织学变化。实验五:补肾化痰中药对烟熏慢支动物檬型下丘脑-垂体-性腺轴的影响小鼠采用摘服球取血,大鼠于氯胺酮门 mg儿g,腹腔注射)麻醉后腹主动脉抽血,离心,分离血清,分装后二0℃保存。采用放射免疫法测定血清睾酮门*促黄体生成素1H入 促卵泡生成素吓SH人中文摘要泌乳素0RL)的含量。剖取睾丸、附睾称重,计算其脏器指数。并将睾丸放入4%的甲醛溶液中固定。取材、乙醇梯度脱水、石蜡包埋,4叼切片,HE染色。光镜下观察各组小鼠和大鼠睾丸组织的病理组织学变化。实验六:补肾化痰中药对烟熏小鼠慢支模型气管、肺及睾丸组织雄激素受体uR)mRN^的影响小鼠于摘眼球取血后迅速剖取气管、肺和睾丸置液氮中冷冻保存,异硫氰酸肥-苯酚-氯仿一步法提取总RNA,并采用逆转录-聚合酶链反应(RTPCR)技术测定各组小鼠气管、肺和睾丸组织AR mRNA的表达量。实验七:补肾化痰中药对烟熏大鼠慢支模型气管、肺组织雄激素受体uR)表达的影响大鼠于氯胺酮(3mg/k,腹腔注射)麻醉后剖取气管和肺,4%多聚甲醛固定,乙醇梯度脱水,低熔点石姥包埋,3-4urn切片,采用免疫组织化学LAB8A法染色,HE复染,二甲苯透明,封片。以PB S代替一抗作为阴性对照,以睾丸标本作为阳性对照,以细胞浆或核内出现棕黄色颗粒为阳性细?……   
[关键词]:慢性支气管炎;补肾化痰;雄鼠;雄激素受体;生殖内分泌;白细胞介素;神经肽;免疫组化;逆转录-聚合酶链反应;组织病理
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:河北医科大学2002年