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猪α型干扰素基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

陈涛

  干扰素(IFN)是一类重要的细胞因子,具种属特异性,在同种细胞上具有广谱的抗病毒、抗细胞增殖、免疫调节等多种生物活性。其中IFN-α/β是机体的第一抵御病毒体系。猪是一种重要的经济动物,利用重组DNA技术生产有广泛抗病毒效应的基因工程猪α型干扰素(PoIFN-α)无疑有重要意义。本研究从猪肝细胞中提取基因组DNA,运用常规PCR方法扩增得到一个内部含终止子的假基因,登录Genebank号为AF350425。比较此假基因序列和PoIFNα1基因序列的差别,结合AS-PCR方法及SOE技术获得了猪α型干扰素基因的成熟肽编码区。所得序列记为PoIFN-α1a,与PoIFN-α1基因成熟肽编码区相比有5个碱基差别,导致3个氨基酸不同。首先以非融合蛋白形式进行表达。将PoIFN-α1a插入到原核表达载体pGRW,转化大肠杆菌DH5α,得到的重组菌株经诱导有以包涵体形式表达的目的蛋白条带出现,表达量约10%。提取包涵体,变、复性后,以WISH/VSV系统检测其抗病毒活性约为3200IU/mg。而采用巨引物PCR法介导的定点突变将PoIFN-α1a第86位的Cys突变为Tyr,同时将N端首位氨基酸(Cys)的密码子TGT同义突变为大肠杆菌偏爱的密码子TGC,突变后基因记作PoIFN-α1b。将其与融合蛋白表达载体pGEX-4T-3连接,转化大肠杆菌BL-21,诱导后表达产物占菌体总蛋白的20%。将以包涵体形式表达的目的蛋白经变、复性处理,并以FPLC进一步纯化,得到产物在WISH/VSV系统上的抗病毒活性为5200IU/mg。……   
[关键词]:猪α-干扰素;AS-PCR;SOE;定点突变;包涵体
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:南京师范大学2002年