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苹果多酚HPLC测定方法及碱性磷酸酯酶在毕赤酵母中表达体系的建立

杜中军

  为建立能全面测定苹果果实多酚的HPLC方法,同时为苹果营养标签的制定提供不同销售时期苹果多酚含量的依据,指导贮藏方式和时期的选择,明确的消费信息,自2001年8月24日至2002年5月15日,由法国果蔬跨行业技术中心提供普通冷藏、气调和超低氧方式下,不同销售时期的嘎拉(Malus,CV.gala)和金冠(M.cv.golden delicious)为试材,根据苹果食用习惯将果实分为果皮、果肉和果心二部分,利用硫解HPLC和非硫解HPLC定量分析世界主栽品种金冠和嘎拉果皮和果肉多酚物质含量,并对不同贮藏方式下和同一贮藏方式下的不同商业贮藏时期多酚物质含量作了比较。该研究对指导贮藏方式和贮藏时期的选择以及苹果消费具有一定的参考意义。具体结果如下:1.硫解和非硫解HPLC相结合能较全面地定量分析苹果果实中主要多酚化合物种类和含量。硫解HPLC分析儿茶素类及其末端单元和二氢查耳酮(根皮苷和木糖根皮苷);非硫解HPLC分析羟基肉桂酸类、原花青素B2、花青素及儿茶素单体。2.嘎拉和金冠中多酚化合物种类不同,已知嘎拉果皮中含有花青素-山越橘苷,而金冠中没有;本实验发现金冠果肉中含有槲皮苷,而嘎拉果肉中没有检测到。3.苹果多酚含量(以mg/kg鲜重计):以黄烷醇类化合物含量最高,约占总酚的78-85%,其次是羟基肉桂酸类25%左右、黄酮醇类8.2-8.5%、二氢查耳酮1.6-3.6%、花青素2.2%。4.嘎拉多酚总量(以mg/kg鲜重计)是金冠的1.94倍,其中,果皮是金冠的2.20倍,果肉是1.21倍;嘎拉中原花青素B2是金冠的4倍;其它多酚一般是金冠的1.4-2.2倍。但金冠的根皮苷含量高于嘎拉。5.金冠果实中多酚在贮藏过程中变化幅度小于嘎拉:从总酚含量稳定性和苹果贮藏成本考虑,金冠能够普通冷藏到84天、气调到157天、超低氧贮藏到182天;嘎拉能普通冷藏到55天、气调贮藏107天、超低氧贮藏161天。杜中军征果多闲*P*C测定方法及碱性磷酸酯酶在毕赤酵母中表达体系的建立碱性磷酸酯酶是分子生物学领域和酶联兔疫分析中常用的工具酶之一,人胎盘碱性磷酸酯酶(hPLAP)(EC3.1.3.l)的活性和耐热性都高于常用的大肠杆菌碱性磷酸酯酶(EAP)和小牛肠碱性磷酸酯酶(CIAP),因而更适用于分子生物学和酶联免疫领域,然而其米源受到限制,探讨利用毕赤酵母尺尸astorjs构建工程菌进行规模生产凤有)’‘阔的前景。本研究将 hPLAP基冈兑隆到 sPICZ o A质粒中并在毕赤酵母尸 Pastorjs蛋白酶缺陷菌株 SMDI 168中诱导表达,获得了有活性的分泌型 hPLAP。主要结果如卜:1.在毕赤酵母几 psrtorjsSMDI 168e株中用表达载体pPICZ Q A成功表达了去掉信号肽的有活性的碱性磷酸酯酶hPLAP。2.对部分克隆进行诱导表达发现只有2拷贝转化子表达产物hPLAP &活性最高,过高过低拷贝数均不利丁hPLAP的表达。3.改进了重织酵母囱落的PCR鉴定方法:冷热处理法,即挑取单克隆于10 ul水中恳浮,m℃及5分钟、液氮处理2分钟,9了C15分钟,然后进行KR扩增。使得在巫组酵母凶落的PCR 鉴定中不使用蜗牛酶和酵母细胞壁裂解酶就可以获得鉴定结采。……   
[关键词]:苹果;多酚;硫解HPLC;毕赤酵母;碱性磷酸酯酶;表达
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:山东农业大学2002年