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生姜蛋白酶的分离纯化及其部分特性的研究

代景泉

  生姜蛋白酶是继木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等之后发现的一种新的植物蛋白酶,它在结构和性质上与上述蛋白酶有很大的同源性,被认为是木瓜蛋白酶家族的又一新成员。生姜蛋白酶能够特异地水解P_2位置是脯氨酸的肽和蛋白质,这种对Pro的特异性使生姜蛋白酶成为一种非常有前途的用于蛋白质测序和蛋白质中稳定结构域识别的工具酶。生姜蛋白酶具有凝乳的性质,我国传统食品“姜撞奶”采用姜汁作为凝乳剂,其中的凝乳因子已被证明是生姜蛋白酶。生姜蛋白酶的凝乳性质使之有望成为奶酪生产中小牛皱胃酶的替代品。此外,生姜蛋白酶在工业上还有更广阔的应用前景。本研究拟针对生姜蛋白酶的特点,制订一套简便有效的纯化方案,为进一步的基础研究和应用研究提供合格的样品酶,并利用纯化得到的样品对生姜蛋白酶的凝乳性质及其对酪蛋白的水解情况进行研究,为其在乳品工业中的可能应用提供参考依据。经过实验确立了以下纯化方案:将生姜制成丙酮粉,然后用20倍(W/V)0.1M,pH8.0的磷酸缓冲液提取;上清液加硫酸铵至40%饱和度,其间控制pH>7.0,离心弃去沉淀,上清液继续加硫酸铵至80%饱和度,离心,取沉淀;将沉淀先对0.1M的氨水透析两小时,然后对蒸馏水透析至无SO_4~(2-)检出,最后对层析初始缓冲液进行延长透析至内外离子强度相等;上DEAE-纤维素DE-52柱;层析初始缓冲液为0.01M,pH8.0Tris(含0.5mMDTT,0.2MNaCl),0.05-1MNaCl梯度洗脱,柱1.5×5.0cm,流速0.75cm~3/min,收集速度3ml/管,收集酶活峰,得到在SDS-PAGE上表现为一条带的样品C_1和C_2。实验中发现生姜蛋白酶具有酸性蛋白的性质;生姜蛋白酶主要存在于生姜植株的根状茎部分;冷冻有助于提取率的提高;超临界CO_2萃取后的残渣不能作为提取生姜蛋白酶的原料。利用纯化得到的样品作了生姜凝乳方面的研究,发现样品C_1具有凝乳活力,1蛋白酶活力单位相当于15R.U.的凝乳活力;样品C_2没有凝乳活性;样品C_1可使干酪素中全部的β-caseins和α-caseins的大部分迅速降解,而在凝乳的过程中则对caseins的水解作用较小。样品C_2对干酪素和复原乳中的caseins成分水解作用都很微弱。……   
[关键词]:生姜;蛋白酶;纯化;凝乳
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:山东农业大学2002年