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A型魏氏梭菌类毒素疫苗与抗毒素血清的研究

刘文波

  本研究从莱芜、泰安、潍坊三个养兔场发生疑似梭菌性下痢的病兔体内分离到三株魏氏梭菌,鉴定为A型魏氏梭菌,对其中一株进行了深入研究,命名为FD株。分别利用该分离菌株和A型魏氏梭菌标准株所产外毒素经甲醛灭活并加入氢氧化铝胶佐剂吸附浓缩后制备了A型魏氏梭菌类毒素疫苗。将该苗免疫家兔并对其血清毒素抗体消长规律进行了测定。另外,对A型魏氏梭菌α毒素的提纯方法和A型魏氏梭菌抗毒素血清的制备也进行了研究。结果表明:制备的A型魏氏梭菌类毒素疫苗的免疫效果良好;提取了较纯的魏氏梭菌α毒素;制备的A型魏氏梭菌抗毒素血清效价较高,且安全性好。本研究共分四部分:第一部分:A型魏氏梭菌的分离鉴定分别以莱芜、泰安和潍坊三个养兔场疑似梭菌性下痢的发病兔的肝和各段肠管做为病料进行了魏氏梭菌的分离鉴定。通过纯分离培养,需氧及厌氧环境的对照培养,形态观察、API 20A系统生化试验,毒素检查及血清型鉴定试验等对分离细菌进行了鉴定,通过毒素检查,也证明了腹泻兔肠道内有毒素存在。细菌学检验结果与魏氏梭菌完全相符合,最终通过血清型鉴定试验,确定从病死兔分离到的细菌为A型魏氏梭菌。第二部分:A型魏氏梭菌α毒素的提取和纯度鉴定将A型魏氏梭菌标准株和FD株所制备的除菌培养物分别以50%和40%饱和度的硫酸铵溶液进行两次盐析。所得沉淀溶解后先经SephadexG-25层析脱盐处理,再经SephadexG-200层析,并用魏氏梭菌定型血清和各管收集液进行琼脂扩散试验以检测层析液的α毒素免疫活性。将含有α毒素的层析液合并浓缩后则能得到较纯的毒素。经SDS-PAGE(SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳)表明:所提纯α毒素电泳图谱只显示一条带,其分子量大约为43.6KD,与已报道的标准α毒素分子量相符合,故该方法可用于α毒素的提纯。第三部分:A型魏氏梭菌类毒素疫苗的研制分别将魏氏梭菌标准株和分离株接种营养肉汤进行增菌培养,然后再接种Gordon汤,43℃厌氧振荡培养6~7h。所得培养物经低温高速离心后,上清液用蔡氏滤器过滤即得魏氏梭菌粗制外毒素。经测定其对小白鼠的LD_(50)分别为10~(2.17)/ml和10~(1.83)/ml。该外毒素用0.3%甲醛,分别灭活8h、16h、32h、64h、128h,加入铝胶佐剂浓缩制得魏氏梭菌类毒素疫苗。对该苗分别进行了安全性检验、免疫效力试验,并对免疫家兔在1~23周血清中的抗体消长规律进行了研究。结果表明用0.3%甲醛灭活32h可将魏氏梭菌外毒素完全灭活。制备的魏氏梭菌类毒素疫苗安全性好,两个菌株制备的疫苗对家兔的有效免疫剂量都为2ml/只,保护率可达100%。接种后第7天家兔血清中毒素抗体效价较低,以后毒素抗体效价逐步升高,到第四周抗体效价达最高峰,平均毒素抗体效价分别为7.125log2(标准株)和6.6log2(FD株),维持约3个月后缓慢下降,至23周时血清平均毒素抗体滴度仍在3.4log2以上。其中接种魏氏梭菌标准株类毒素疫苗的家兔血清平均毒素抗体效价最高值比FD株组高0.525log2。但经t检验,接种两疫苗的刘文波:A型魏氏梭菌类毒素疫苗与抗毒素的研究家兔产生的平均抗体水平差异不显著(P>0刀5)。第四部分:A型魏氏梭菌抗毒素血清的制备利用A型魏氏梭菌标准菌株制备的灭活菌苗作为制备A型魏氏梭菌抗毒素血清的第一抗原,用其产生的外毒素作为制备A型魏氏梭菌抗毒素血清的第二抗原。对健康的青壮年绵羊用灭活菌苗进行了3次基础免疫,再用外毒素进行7次高免后,采血分高血清制得了A型魏氏梭菌抗毒素血清。经检验,该抗毒素血清安全性好,且效价较高,可用于魏氏梭菌病的紧急预防或治疗。……   
[关键词]:A型魏氏梭菌;类毒素疫苗;抗毒素血清
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:山东农业大学2002年