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尼古丁对鼠牙胚发育影响的研究

王小竞

  在烟草的毒性物质中,尼古丁是主要成分。它是烟草中的生物碱,无论是主动吸烟或被动吸烟,作为烟草的活性成分,进入母体血液中的尼古丁可迅速通过胎盘分布,对正在发育的胎儿产生影响。它不仅影响胎儿的全身发育过程,而且干扰了子代颌面部的腭、舌,尤其是牙齿的发育。流行病学调查表明,吸烟可影响子代牙齿发育,动物实验研究也观察到尼古丁可造成牙胚体积缩小,发育迟缓等现象。以往的研究中,人们虽然在形态学方面观察到尼古丁对牙胚发育的影响,但是尼古丁通过何种途径、怎样影响牙胚发育的研究,目前国内外尚未见报道,很有必要深入研究。本研究目的是探讨尼古丁对小鼠牙胚发育的影响和可能机制,共进行了4个部分的13个实验:1.尼古丁对小鼠牙胚发育影响的形态学研究选用Balb/c鼠54只,按雌、雄比例3:1同笼,将26只孕鼠分为实验组和对照组,实验组妊娠鼠以1.67mg/kS/d腹膜腔注射尼古丁硫酸盐,注射天数为孕龄6d~20d,在孕龄16d、18d及20d处死动物。从各组胎鼠中选出3~5只行常规组织学制片,HE染色,光学显微镜下观察。从20d孕鼠的胎鼠选出3~5只制做透射电镜标本,电镜下观察。结果,与对照组相比,实验组胎鼠存活数下降,体重减少;光镜下见对照组各组牙胚分别处于其相应的牙胚发育时期,各时期的牙胚发育正常;实验组与相同时期对照组牙胚组织相比体积减小,发育迟缓,细胞数减少,分化程度减弱;电镜下见对照组牙胚细胞胞浆丰富,核仁清晰和线粒体嵴丰满,核内可见到核丝分裂像,而实验组牙胚细胞缩小,核仁不清晰、线粒体肿胀、基质变淡和嵴消失,细胞第四军医大学博士学位论文内出现空泡,开始变性。说明,尼古丁抑制了鼠牙胚的生长发育。证实,尼古丁对胎鼠发育中的牙胚和细胞有一定的毒害作用。02.尼古丁作用下小鼠牙胚发育中烟碱受体表达的研究在孕龄16d、18d、20d处死孕鼠,实验组和对照组各取3—5只胎鼠制备标本,以人抗烟碱受体抗体行免疫组化染色:取以上各组胎鼠牙胚,分别提取牙胚组织的蛋白和 RNA,进行 Western blot和RT-PCR。免疫组化结果观察到,正常发育的牙胚组织中存在nAChR的表达,尼古丁作用于牙胚组织后,使发育中牙胚组织 nAChR的表达上调;Western hi仇和 RTFCR结果表明,正常发育的牙胚组织中存在nAChR。,蛋白和dChRa,mRNA;尼古丁作用于牙胚组织后,可使发育中牙胚组织dChR a,蛋白和nAChR a。rnRNA表达上调。本部分研究结果在蛋白和InRNA水平证实了正常发育的牙胚组织中存在dChR,尼古丁作用于牙胚组织后,可上调发育中牙胚组织dChR蛋白和InRNA的表达,提示,nAChR可能介导了尼古丁对牙胚生长发育的影响。3.a-银环蛇毒素对尼古丁作用下小鼠外胚间充质细胞增殖、生长周期及钙离子浓度变化的研究本部分研究有5个实验,即:()采用酶消化法建立Balb/。鼠未分化外胚间充质细胞体外实验模型;(二)采用免疫组织化学方法检测外胚间充质细胞的nAChR的表达;D)采用Mrs法观察在nAChR桔抗剂a-Bgt的作用下,尼古丁对外胚间充质细胞增殖的抑制作用;(4)采用FCM观察在dCbR桔抗剂阶*寥的作用下,尼古丁作用于外胚间充质细胞后其细胞周期的变化:(5)采用荧光标记示踪法与激光共聚焦扫描技术共用的方法观察在dChR桔抗剂a习gt的作用下,尼古丁造成外胚间充质细胞内Caz”浓度变化的情况。3第四军医大学博士学位论文结果,()在本实验条件下,培养的的外胚间充质细胞性能是稳定的,可用于实验:(2)观察到鼠外胚间充质细胞存在nA*hR;(3)尼古丁对细胞增殖的抑制作用降低;N)尼古丁和 a-Bgt共同作用组可明显升高s期、降低G期细胞的百分比,表明,尼古丁对间充质细胞增殖的抑制作用减弱;(5)nAChR g抗剂aEgt可阻断尼古丁造成的细胞内Ca升浓度升高。证实:鼠外胚间充质细胞存在dChR。推测尼古丁对外胚间充质细胞的作用可能是由nAChR介导的,nAChR可能介导了尼古丁对牙胚生长发育的影响。4.尼古丁作用下小鼠牙胚发育中转化生长因于表达的研究本组实验采用免疫组织化学、Western blot和 RT-PCR的方法,对尼古丁作用于牙胚组织后TGF p;表达的变化在蛋白和InRNA水平进行了研究。结果,正常牙胚的各发育时期,在牙胚的内釉上皮细胞、成牙本质细胞和牙乳头组织中都呈现TGF pl阳性表达,实验组各阶段TGF-el的阳性信号均较对照组减弱。?……   
[关键词]:尼古丁;Balb/c鼠;牙胚发育;超微结构;烟碱受体;RT-PCR;α-银环蛇毒素;外胚间充质细胞;生长周期;转化生长因子-β
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:第四军医大学2002年