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结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B基因的克隆、表达、纯化及免疫学特性的初步研究

薛莹

  结核病(tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)所致以呼吸道为主的慢性传染病。目前全球有1/3的人口感染MTB,每年有1000万的新发病人和300万的病人死亡,表明TB仍是影响全球人类健康的一个主要公共卫生问题。大量的动物实验研究证实,MTB培养滤液蛋白(CFP)可诱导产生保护性T细胞免疫反应。Andersen等发现刺激免疫反应成分主要是集中在4-11kDa和26-35kDa范围的蛋白分子。已知的有ESAT-6、MPT-64、Ag85复合体、MPT32等。另一类保护性抗原为热休克蛋白,主要是Hsp70、Hsp65等。Sinha等比较了6种不同的分泌蛋白的免疫学特性,发现在小鼠体内30kD(Ag85B)蛋白可提供优于BCG的保护效果,表明该蛋白可能是一个关键的免疫保护分子。结核分枝杆菌抗原85复合体是牛分支结核杆菌(M.bovis),卡介苗(BCG)及结核分支杆菌短期培养液中的主要分泌蛋白。对第四军医大学硕士学位论文流免疫电泳可将此蛋白分为 Ag85A人g85B 和 Ag85C三组分,其中Ag85A人g85B可与人纤维连接蛋白结合,参与结核病病变的形成。此复合体是诱发健康接触者体内保护性免疫反应的最主要的抗原,它可引起健康接触者外周血单核淋巴细胞的增殖,且刺激T细胞释放IFN-Y及IL-2。本研究构建了Ag85B蛋白的原核表达载体P皿”以叮‘I田0,并将其转入E.COlt DHS Q中获得了高效表达。我们采用皮下包埋的方法用转移到硝酸纤维素膜卜的表达蛋白带对小鼠进行初次免疫,然后再用SDS-PAGE8)上的表达带对小鼠进行后两次免疫,同时设BCG免疫组和生理盐水阴性对照组。免疫完成后第2周ELISA法检测免疫小鼠体内Ag85B的体液免疫应答效果,结果Ag85B和BCG免疫组小鼠血清中Ag85B特异性抗体的滴度分别为1:160和 1:80。为了检测 Ag85B和 BCG免疫小鼠体内引起的细胞免疫反应,免疫完成后第2周,分离免疫小鼠的脾淋巳细胞,体外用抗原再刺激,生物学方法检测 IFNb,的产生水平和 MTT法检测淋巳细胞增殖反应。结果可见Ag85B蛋白免疫小鼠和 BCG免疫小鼠脾细胞分泌的 IFN,白量分别达到960pg.L1和 814 pg.L刁。而生理盐水对照组的低于 80 pg.L叫。而且脾淋巴细胞增殖显著,其刺激指数分别为 3.495和二.463。而生理软水对照组淋巳细胞的增殖不显著,为0.975。综上所述,采用原核表达的Ag85B蛋白免疫小鼠后,在小鼠体内可引起保护性的细胞免疫反应,表明该蛋白有可能作为新型结核疫苗的组分。……   
[关键词]:结核分枝杆菌;Ag85B;原核表达;纯化;免疫学特性
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:第四军医大学2002年