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转PGH基因蚕构建研究及转GFP和neo~r蚕的继代分析

魏玲

  家蚕是研究真核基因表达调控的理想模式生物之一,又是一种重要的经济昆虫。家蚕转基因研究不仅可促进基础分子生物学研究,而且对改进育种方法,利用家蚕作为生物活性物质的反应器等有着重要的理论意义和广阔的应用前景。本文着重选择了动物转基因研究中用得较多也比较成熟的猪生长素全基因(PGH)作为外源基因,再与家蚕自主启动子即丝素基因启动子相连,通过精子介导法导入家蚕,以分析其整合情况,以及在丝素启动子的启动之下,PGH基因的表达情况。同时将陈清轩等用绵羊金属硫蛋白-1启动子和猪生长激素基因(PGH)构建成的可调控的表达载体pSMTPGH转入家蚕,以分析其整合情况,另外对本室构建的转水母绿色荧光蛋白基因(GFP)阳性个体进行继代选择,包括PCR或Southern杂交检测。通过以上工作,以期对家蚕转基因研究提供一些实验依据,从而为开展家蚕转基因育种和以转基因手段制作生产高附加值药用蛋白的转基因蚕奠定基础。1.重组质粒载体pFbPGH的构建质粒pFb100以SmaI和HindIII双酶切,电泳并分离回收约1000bp的丝素基因启动子小片段,先将其连在pUC19上,然后经过多次连接将猪生长激素基因连接在丝素基因启动子下游。该构建的表达质粒保留了丝素基因启动子的TATA Box及CAP位点等结构,PGH上的转录调控区及转录起始位点被去掉,但起始密码子、外显子和加PolyA尾的信号等都保持了原状,这样重组的PGH完全在丝素基因启动子的调控之下,不再受生长激素释放因子等的影响。2.转pFbPGH蚕和转pSMTPGH蚕的制作及检测2.1质粒pFbPGH和pSMTPGH的导入以精子介导法将质粒pFbPGH和pSMTPGH导入夏秋用蚕品种夏芳。具体操作为:将5ul(2μg/μl)携带外源基因的质粒以毛细管玻璃拉成的玻璃针注入处女蛾交尾囊,然后让其与雄蛾交配。收集处理蛾所产的卵进行饲养检测。2.2转pFbPGH蚕和转pSMTPGH蚕的分子检测继代2.2.1转pFbPGH蚕和转pSMtPGH蚕的PCR检测继代从GO代各蛾区随机取十头蚕混合提取DNA,以其作为模板经引物特异扩增导入的PGH基因*L 以一定几率(转 PFbPGH蚕为 Zthe,转 PSgrPGH蚕为 Zthe)得到预期大小阳性片段,从而筛选到阳性区。2.2.2转pFbPGH蚕和转pSMTPGH蚕GO 代Southern检狈为了排除PCR假阳性的影响,分别以十头蚕GO代PCR阳性个体DNA各15 Hg,Hindlll酶切后1%琼脂糖凝胶电泳,转移到尼龙膜,以S* 酶切质粒PSgrPGH后的小片段(约1500hp)作为探针用片段,经地高辛标记后,进行Southern杂交,均得到阳性结果。对亲代有阳性的卵圈保留继代。2.2.3转pFbPGH蚕和转pSMTPGH蚕GO 代No。them检狈为了分析PGH基因在转基因蚕中的转录情况,每一蛾区取十头蚕提取总RNA(见图门*取10《0 ugRNA,甲醛变性胶电泳后,转移到尼龙膜。回收Smal酶切质粒psilTPGH后的小片段(约1500hp)作探针用片段,经地高辛标记后进行Northern杂交,但未筛选到Northern杂交阳性区。这种结果的出现可能是由以下几个因素造成的:①可能是取材方面的问题,由于是随机取材,故很有可能出现所取的材料经PCR或Southern检测就无阳性个体存在,因此在以后的实验中可以考虑在蚕幼虫期第五龄的时候,从蚕体抽取部分血液作PCR检测,进行初步筛选,然后再取一部分阳性个体进行Northern检测和 ’Kestern检测,从而判断该转基因蚕是否转录和表达。②在Northern杂交过程中,mRNA可能己被降解,这可通过蛋白质检测(Western检测)验证。3.转绿色荧光蛋白基因蚕和转新霉素抗性基因蚕的继代分析利用PCR技术对本室采用精子介导法构建的转绿色荧光蛋白基因·(GFP)蚕及基因枪法构建的新霉素抗性基因* O蚕进行了继代分析检测,结果在转PFbGFP蚕的GZ和G3代,转PTRIN54蚕的GI及GZ代,均检测到了阳性个体。这说明所构建的转基因蚕具有相对稳定的遗传性。……   
[关键词]:pFbPGH;转基因蚕;pSMTPGH;精子介导法;继代分析
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:西南农业大学2002年