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重组人γ-干扰素生产工艺优化及α-糜蛋白酶复性研究

申烨华

  全文包括两部分。第一部分系统研究了重组人γ—干扰素(rhIFN-γ)的高密度发酵及放大工艺,其产量达7.13g/L,为国际报道的9倍。第二部分在色谱柱上研究难复性的蛋白之—α-糜蛋白酶(α-Chy)的复性条件的基础上,研究了rhIFN-γ的复性与同时纯化条件。一步色谱分离与纯化,使rhIFN-γ的纯度>95%,最高比活1.8×10~8IU/mg,为国家药物标准的11倍。第一部分重组人γ-干扰素高密度发酵及放大研究1.重组大肠杆菌DH5α/pBV220发酵培养基的研究在摇瓶中对工程菌DH5α/pBV220的发酵培养基进行了研究,确定出M_9培养基为基本培养基。利用单因子实验对M_9培养基中的碳源和氮源进行筛选,确定出最优培养基配方M_9Ⅱ。此时,rhIFN—γ的产量为0.65g/L。2.重组大肠杆菌DH5α/pBV220摇瓶发酵的研究通过对工程菌DH5α/pBV220摇瓶发酵中种子菌龄、接种量和诱导时机等工艺条件的研究,确定出摇瓶发酵的最优培养条件。此时,rhIFN-γ的产量为0.72g/L。对培养基中营养成份和pH的分析表明,M_9Ⅱ培养基中的碳源和氮源较丰富,而溶解氧的不足和pH值偏酸性可能是整个培养过程的限制性因素。3.重组大肠杆菌DH5α/pBV220在5L发酵罐上的间歇培养在5L发酵罐中,对工程菌DH5α/pBV220间歇培养时的搅拌速度、通气量和表达时间等工芝条件进行了研究,确定出5L发酵罐间歇培养的最优培养条件。实验结果表明,M_9Ⅱ培养基中的碳源和氮源都是充足的,而溶氧的不足和培养基pH偏酸性可能是整个生产过程中的限制性因素。首次提出,除应以工程菌菌体收获量和目标蛋白表达量为标准外,还应以目标蛋白分离纯化为标准,对不同的发酵条件进行筛选。结果表明,工程菌生长和目标蛋白表达的最佳工艺条件与目标蛋白分离纯化的最仆卜艺条川、川J1川。u,有叫个【。U。4.重组大肠杆菌 DHS a /pBV220在 SL发酵罐上的高密度流加培养在SL发酵罐中,通过筛选培养基、溶氧水平、诱导时机和碳源种类等条件,确定出工程菌 DHS u /pBV220分批流加的优化工艺条件,使 rhlFN-Y的产量达7.13g几,与己查阅的文献相比,达到国际水平的9l倍。对分批流加培养时深层发酵的过程参数进行分析表明,MJV培养基中的碳源、氮源和溶氧都是充足的,培养基叫>7刀,消除了整个+产过W中的限制忖w素。闩次建立了一申1。筛选培养基配方的新的试验设计方法。泊方法只而进订一轮。‘n.囚了实验,即可采用逐少口归技术建立优化数学模型,再利用计算机对松囚于实验数据进行分析,筛选出主要因子影响,确定出最佳培养基配方。该试验设计方法实验次数少,可避抡筛选工作中的局部优化问题,并可为分批流加发酵提供流加依据。5.DHS a巾BV220在 50L发酵罐上的放大研究选用合适的放大原则,将SL发酵罐的间歇培养和分批流加培养的工艺条件,成功地放大到50L发酵罐中。在50L发酵罐问歇培养时,rhIFN-Y的产量为2.33g/L。在 50L分批流加培养时,菌体密度为OD60029.93,细胞干重为14 *g/L,*IFN-g的产量为 7刀旮/L,与已查阅的文献相比,达到国际水平的 9刀倍。第二部分a-糜蛋白酶及重组人v-干扰素复性研究二.腑变a.糜蛋白酶的液相色谱复性首次提出将疏水填料加入变性剂中,防止蛋白在变性过程中聚集的方法。设计出实现这一方法的进样装置。比较了三种不同的疏水填料,使a-Chy的活性回收率山36.1%提高到59刀%。首次肾1_1该川去的机理。结果表明,疏水填料除具有类似于分于伴侣的作川,防止变性蛋白聚集,为变性蛋白的复性提供帮助外,构成疏水填料的配基物质的结构对蛋白复性效率的提高也有帮助。发现变性剂中加入某些物质既可防止变性蛋白的聚集,还可提高复性效率,并与加入物质的浓度有关。此外还发现,当变性剂中加入的疏水填料与色谱柱中装填的疏水填料相同时,a(hy的活性回收率提高最多。2.重组人Y干扰素的复性与同时纯化二在优化出的疏水色谱条件下,rhIFN-Y的 7刀mol/L GuHCI提取液,只经过一步疏水色谱纯化,rhIFN-Y的纯度可达 96.6%,rhIFN-Y的总比活可达1.8 X108IU/mg。只经过1次疏水色谱,用30min就可使活性回收率达到1207%。与己报道的文献相比,是国内生产水平的4.3倍,与国家药物生产要求的1石X10’IU/mg相比,是其 11.3倍。……