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棉纤维细胞分化和发育功能基因的研究

徐亚浓

  本研究以纤维发育正常的陆地棉品种“徐州142”和海岛棉品种“PimaS-4”为对照,以3个纤维突变体“徐州142无絮”(无纤维无短绒)、“徐州142光子”(无短绒)和“Ligon棉”(极短纤维)为材料,比较了正常棉与无絮突变体胚珠内控制纤维细胞突起相关酶活性的变化,以及正常纤维与极短纤维细胞内的可溶性糖、苹果酸、相关酶及其基因表达等方面的变化,研究了纤维细胞突起、伸长和纤维素合成的相关因素,探讨了棉纤维分化与发育的相关机理。研究主要包括以下几个方面:一、棉纤维细胞RNA提取方法的比较研究为高质量提取棉花纤维细胞的RNA,进行了三种提取方法的比较研究。研究表明,用高离子、高pH值提取液提取棉花纤维细胞的RNA比TRIZOL与异硫氢酸胍两种提取液更适合。高离子、高pH值提取液的特点是:pH值偏碱性,加入脱氧胆酸钠及NP-40两种盐类,提高其他盐类的浓度,并加入PVP和巯基乙醇两种抗氧化剂。用本方法提取的棉花纤维等组织细胞的RNA,纯度高,不降解;如棉纤维细胞RNA的A:Ano可达1.85,平均得率为0.65mg.g ’,适合于Northern杂交及RT-PCR等分子生物学实验研究。由此法所提取的徐州142正常棉基因组DNA的A:印/A:RD可达2.09,平均得率为1.44mg.g ’,不降解,酶切完全,适合于一般DNA分子操作的酶学反应。二、蔗糖合成酶对纤维细胞突起、伸长和纤维素合成的作用具有大量纤维细胞突起的徐州142、Ligon棉及海岛棉PimaS-4在开花当天(0DPA)胚珠中的蔗糖合成酶活性,与开花前1天(-1DPA)胚珠比较,分别升高了169.05%、68.11%及154.84%;而在光子和无絮突变体胚珠中,酶活性各下降了64.7%和51.4%。随后的0~5DPA期间,徐州142胚珠的酶活性均比其它材料高,并在2DPA达到峰值,无絮突变体酶活性仍处较低水平且变化不大。蔗糖合成酶的功能之一是摧化蔗糖为果糖和UDPG,果糖和UDPG可为纤维细胞突起提供能量和物质。因此,蔗糖合成酶活性的高低可能直接影响到纤维细胞的突起。在10~30DPA,蔗糖合成酶在各组织细胞中的活性高低为:纤维细胞>种皮细胞>胚细胞,与纤维素在这些组织细胞中分布基本相同。Ligon棉纤维细胞的蔗糖合成酶活性在15DPA有个小峰值,其余四个材料在20DPA有个峰值,这与它们次生壁开始增厚时间相一致。在30DPA以后,除了胚细胞外,纤维和种皮细胞中的蔗糖合成酶活性都急剧上升,而纤维和种皮细胞内的纤维素含量也在此时期升高,胚细胞内的纤维素含量比较低。由此可知蔗糖合成酶与纤维素的合成相一致。三、蔗糖酶对纤维细胞初始伸长的调节作用在-1~5DPA,5个材料的胚珠中都未检测到蔗糖酶的活性。在10~40DPA,徐州142正常棉纤维细胞的蔗糖酶在15DPA活性达到最高值,随后急剧下降。海岛棉PimaS-4在20DPA纤维中活性达最高值,随后缓慢下降。Ligon棉在10~25DPA内变化幅度不大,一直低于徐州142正常棉和海岛棉PimaS-4。可见,蔗糖酶是在纤维细胞初始仲长期大量表达的,它的活性高低可能影响纤维细胞的初始伸长。徐州142无絮突变体胚和种皮细胞内在10~15DPA检测不到酶的活性,随后能检测到酶活性,但比较低。令人奇怪的是以徐州1忙正常棉川、150PA胚珠为材料时世检测不到蔗糖酶活性。在胚或种皮细胞中可能存在着某种抑制蔗糖酶活性的物质,以至在胚珠发育前期都不表达。四、可溶性糖和苹果酸对纤维细胞的突起、伸长及纤维素合成的作用在-l~ZDPA期间,可溶性糖含量在5个材料胚珠内变化不明显。在SDPA,可溶性糖含量在徐州142正常棉、Ligon棉及海岛棉PimaS-4胚珠内急剧上升,与-IDPA相比,分别增加了254.08o、214.93%、200.0卜九:而光子棉胚珠仅上升了3丁27九,无絮突变体胚珠反而下降了35.18%。在l(k40DP期间·徐州142正常棉、海岛棉PqthaS-4及Ligon棉的胚珠可溶性搪含量呈下降趋势,在10DPA均达最高值,分别是40DPA的9.379倍、542倍、628倍;但Ligon棉在10DPA的可溶性糖含量分别比徐州142和海岛棉*_拈-4低了门43%和16.73%。无絮突变体胚和种皮细胞可溶性糖含量在IMODPA呈下降趋势,且远远低于纤维细胞内的含量。差异显著性分析结果表明,在ODPA各材料之间无显著性差异,在SDPA无絮突变体与其他4个材料胚珠内的可溶性糖含量差异达到极显著水平。可见液泡中由可溶性糖引起的膨压对纤维细胞的突起影响不大,但对纤维细胞的初始伸长影响很大。胚珠苹果酸含量,在徐州142正常与徐州142无絮两个等基因系间,仅在SDPA胚珠中有极显著性差异,但无絮胚珠中的苹果酸含量高于徐州142正常棉,可见由苹果酸引起的膨压对纤维细胞的突起影响不大,但对纤维细胞的初始伸长可能存在着影响。在lffe30DPA,各纤维细胞中苹果酸含量变化幅度不大,随后急剧上升。经显著性分析,徐州142正常棉与Linon棉纤维细胞内的苹果酸含量在200 PAPA、330PA达显著性差异水平,在这?……