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合浦珠母贝碱性磷酸酶的分离纯化和性质研究

林静瑜

  以合浦珠母贝(Pinctada Fucata)的外套膜和内脏团为提酶材料,经Tris-HCl缓冲液(pH8.9)抽提,正丁醇处理,硫酸铵分级分离获得粗酶制剂,进一步经过Sephadex G-150凝胶过滤柱层析,DEAE-32离子交换柱层析等纯化,获得电泳和层析单一纯的碱性磷酸酶制剂,比活力达8723unit/mg。测定酶的分子量为85.5kD,是由两个分子量为43kD的相同的亚基组成。该酶对底物pNPP的水解反应的最适温度是45℃,最适pH为9.72,活化能为20.14kJ·mol-1,初速度为6.1μmol·L-1·min-1。米氏常数Km为2.86mmpl/L,最大反应速度Vm为9.09μmol/(L·min)。HPO2-4是合浦珠母贝碱性磷酸酶催化pNPP水解的产物之一,WO3-4是产物类似物,它们对酶均起了较强的抑制作用,其中10mmol/L的HPO2-4使酶活力仅余29%,而10mmol/L的WO3-4使酶活力仅余33%,它们对酶活性的抑制类型均是竞争性抑制。正一价和正三价的金属离子对酶活力无影响。正二价的金属离子中,Mg2+、Ca2+、Mn2+、Co2+对酶有明显的激活作用,其激活程度分别为164.7%、134%、226.2%、128.64%;而Cd2+、Pb2+、Zn2+、Cu2+对酶有抑制作用,其抑制效果分别为82.3%、73.2%、23.68%、30.9%。其中,Mg2+对酶的激活作用是非竞争型激活。Co2+对酶的激活作用不同于Mg2-的激活类型,属于竞争型激活。Mn2+对酶的激活类型不同于Mg2+和Co2+,属于混合型激活。Zn2+对酶的抑制类型是典型的反竞争型抑制。DTT对酶有明显的抑制作用,随着DTT浓度的加大,酶逐渐丧失活力。DTT对酶的抑制类型属于非竞争型抑制。EDTA是一种金属离子鳌和剂,它能夺走碱性磷酸酶分子内的金属离子。以EDTA为效应物,随着EDTA浓度的增大及作用水时间的延长,酶分子内的金属离子逐渐丧失,酶活力下降,直至完全失活。关于EDTA对酶的抑制类型属于竞争性抑制作用。以盐酸胍、脲及SDS为变性剂,紫外光吸收图谱表明酶分子的构象发生了变化。6mol/L的盐酸胍能使酶活力下降到3%,而同样浓度的脲只能使酶活力下降到28.1%,50mmol/L的SDS使酶活力仅余4.7%。酶化学修饰的研究结果表明,酶活性中心有一个组氨酸残基、一个色氨酸残基,而且赖氨酸的氨基、精氨酸的肌基也是酶活性中心所必需的,但半脐氨酸的疏基则不是酶活性必需的基团。研究盐酸腑对酶的失活动力学,发现经过盐酸弧预处理24 h的酶是不可逆失活,整个动力学模型呈不可逆的竞争性抑制。研究插核对合捕珠母贝外套膜上碱性磷酸酶比活力的影晌,结果表明,开始由于创伤,该酶比活力下降,而后开始提高,可见在珍珠质形成和分泌的过程中,该酶的比活力会有明显提高。关于一些药剂对外套膜小片上碱性磷酸酶活力的影响的试验结果表明,PVP、ATP、促珠泌素混合试剂能较有效提高酶活力,这对人工育珠的产量和质量有一定的影响。……   
[关键词]:合浦珠母贝碱性磷酸酶;理化性质;功能基团;效应物;抑制动力学;构象;外套膜;插核
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:厦门大学2001年