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冰核细菌Erwinia ananas 110冰核基因克隆、序列分析和促冻杀虫基因工程菌构建

唐朝荣

  细菌冰核基因的应用研究已成为生物冰核领域的研究热点,涉及细菌细胞表面展示、报告基因、病原微生物高敏检测、作物抗寒育种等多个领域,显示良好应用前景。在本研究开展前,我国尚未克隆到细菌冰核基因,因此无法开展冰核基因的应用研究。大量研究证明,冰核细菌促冻杀虫理论确凿无疑,但难以应用野生型冰核细菌冻杀田间和仓储越冬害虫,主要原因是这些冰核菌不能在虫体内增生定殖,易被排泄体外,无法起到促冻杀虫作用;再者,冰核细菌能在植物体上定殖,田间施用易诱发和加重植物霜冻,这已成为阻碍促冻杀虫应用的国内外难题。基于此背景,拟本研究目标:克隆细菌冰核基因,利用冰核基因构建促冻杀虫基因工程菌。主要结果如下:根据已报道冰核基因的同源序列设计引物,通过PCR扩增从我们分离的冰核细菌Erwinia ananas 110中克隆到一个完整细菌冰核基因。克隆基因编码区全长3921nt,编码1306aa,氨基酸序列明显分为3个区即N-端(161aa)、C-端(41aa)的单一序列区和中部的高度重复序列R区(1104aa),以16氨基酸为重复单元的R区占整个编码序列的84.5%。序列比较表明所克隆的基因为新基因,将其命名为iceA,并已在GenBank上的登录,登录号为AF387802。所克隆基因同国外报道的冰核基因inaA的同源性最高,核苷酸和氨基酸的同源性均为94%。构建了所克隆基因的非融合原核表达载体pINA201,成功实现了冰核基因的原核表达,产生187KDa的冰核基因表达产物。将iceA插到质粒pSZ21的Tn5转座子的SalI和BamHI酶切位点之间,首次成功构建了具广泛宿主接合转移和Tn5转座功能的重组质粒mob-Tn5-iceA。在该重组质粒中,iceA在Tn5转座子的新霉素磷酸转移酶基因启动子控制下实现了冰核基因的组成型活性表达,可通过接合转移将mob-Tn5-iceA导入多种革兰氏阴性菌,并进一步通过Tn5转座将插入在其上的冰核基因iceA整合到宿主菌染色体DNA上,因此该重组质粒的构建将加速冰核基因的应用研究。首次通过接合转移将mob-Tn5-iceA导入阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae1.181和1.2022两个菌株中,并通过Tn5转座作用进一步将冰核基因iceA整合到宿主菌染色体DNA上,成功构建了冰核活性稳定的促冻杀虫基因工程菌Enc181~(ice)和Enc2022~(ice)。0二两株工程菌可显著提高害虫的过冷却点,在害虫肠道能有效定殖、对害虫的低温冻杀效果明显。用工程菌饲菌后7d内,玉米螟和棉铃虫的过冷却点分别从-11℃一 17℃和-10 C左右提高到-3℃一4℃,饲菌后gd,处理虫体的过冷却点有所降低,但仍在-5’C以上。在饲菌后7d内,两种昆虫肠道的工程菌数量高达10‘~105C刊u/虫体,饲菌后gd,虫体肠道内的工程菌数量有所下降,但每虫体的菌体数量仍在10‘cfu以上。将饲菌后6d的玉米螟和棉铃虫在-5’C处理6h,即有90%以上被冻死,而未经工程菌处理的对照虫体则全部存活下来;-7C处理6h,工程菌处理虫体 100%被冻死,而对照玉米螟和棉铃虫中则分别仅有7.4%和14.3%被冻死。两株工程菌在植物体上的附生定殖能力明显低于野生型冰核细菌,大田应用冻杀害虫时会降低诱发霜冻的风险。盆栽试验显示,工程菌在玉米上的定殖能力明显比野主型冰核细菌低。在喷菌后10d,从玉米叶片上很难再分离到Enc2022‘“”,表明该菌难以在植物上定殖,Enc181‘””虽然在喷菌后20d内在玉米上始终有一定数量定殖,但与野生型冰核细菌Eal 10+肚b则要低2个数量级以上。此外,两个工程菌间在植物上的定殖能力也存在明显差异,无论在盆栽试验的玉米上或是在小区试验的玉米和棉花上,Enc2022‘’”的定殖能力都明显低于Enclsl‘“”:在植物体上难以定殖,可排除诱发霜冻的风险,因此大田应用Enc2022‘””促冻杀虫更具应用前景。本项研究结果,为我国冰核基因应用研究创造了新的生长点和奠定了基础,创制出了促冻杀虫新生物农药,为防除我国三北地区重要越冬农林害虫和仓储害虫指出了一条切实可行的生防新途径。……   
[关键词]:冰核基因克隆 iceA mob-Tn5-jceA 工程菌 促冻杀虫 过冷却点 肠道定殖 植物附生定殖
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:中国农业科学院2001年